CARNEIRO, A. A.

CARVALHO, C. H. S. de

DAMIAO FILHO, C. F.

FERREIRA, M. das G. R.

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8-009Resposta de tecidos de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.)  à concentração deauxina e meio líquido (8)Maria das Graças Rodrigues FERREIRA1, Carlos Henrique Siqueira de CARVALHO2, AndréaAlmeida CARNEIRO3 e Carlos Ferreira DAMIÃO FILHO41 CENA/USP, Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Av. Centenário, 303, Cx Postal 96. CEP -13400-970, Piracicaba-SP. E-mail: mgrf23@hotmail.com2, 3 EMBRAPA MILHO E SORGO, Núcleo de Biologia Aplicada, Cx Postal 151. CEP - 35701-970,Sete  Lagoas-MG.4 UNESP, Jaboticabal, Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Via de Acesso Prof.Paulo Donato Castellane, s/n. CEP - 14884-900, Jaboticabal-SP.INTRODUÇÃOO cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum) é uma árvore frutífera, pertencente à família dasSterculiaceas, que encontra-se disseminada por toda a bacia Amazônica, sendo esporadicamenteencontrada em outros países como a Colômbia, Venezuela, Equador e Costa Rica (Venturieri et al.,1985). O maior valor da espécie está na polpa, que se encontra aderida às sementes, é de cor branca-amarelada, sabor ácido e cheiro agradável característico, sendo utilizada in natura  ou na fabricaçãode néctar enlatado, sorvetes, licores, compotas, geléias, iogurtes, etc (Calzavara et al., 1984;Venturieri et al., 1985). Face ao enorme potencial deste fruto nos mercados interno e externo, surgea necessidade de incrementar as pesquisa básicas com esta valiosa espécie do gênero Theobroma.Certas espécies de plantas são recalcitrantes à obtenção de calos em quaisquer tipos de explantes,sendo que algumas gramíneas e muitas espécies lenhosas só produzem calos quando sãoempregadas doses altíssimas de auxinas no meio de cultura (Damião Filho, 1995). Singha (1982)observou aumento da disponibilidade e absorção de nutrientes pelos explantes, quando estes foramcolocados em meios líquido e semi-sólido. Os meios líquidos também permitem melhor diluição deexsudatos oriundos do explante, evitando,  desta forma, o acúmulo de compostos tóxicos. Estetrabalho teve como objetivo estudar o efeito da concentração de auxina e do meio líquido sobre odesenvolvimento de calos de cupuaçu.METODOLOGIAOs experimentos foram conduzidos no Laboratório de Biologia Celular do Núcleo de BiologiaAplicada, pertencente à Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG. Foram utilizados como fonte deexplantes, eixos embrionários e cotilédones, obtidos de sementes de frutos imaturos de cupuaçu. Assementes foram imersas em  solução de 20% de  hipoclorito de sódio (alvejante comercial), durante10 minutos, seguindo-se três lavagens com água bidestilada. Em condições assépticas, oscotilédones foram segmentados e os eixos embrionários das sementes foram divididos em: região daplúmula, radícula e hipocótilo. A seguir, esses explantes  foram esterilizados com solução Ao (antioxidante) por 1 hora  e,  posteriormente, imersos numa solução de 9 ml LS (sais e vitaminas MS -Murashige e Skoog, 1962) + 1 ml de Ao por dez minutos.Os explantes foram cultivados em placasde Petri descartáveis e as culturas mantidas em sala de crescimento, com temperatura variando de24 a 28 C em condições de escuro.  Para cada condição foram feitas  10 repetições empregando-seos seguintes meios:  Meio 1: (50%) sais MS (2,15 g/L) sacarose (60 g/L), água de coco (100 ml/L),2,4-D (1; 2; 4; 8 mg/L), cinetina (0,5 mg/L), gelrite (2,5 mg/L) e pH 5,3 antes da autoclavagem;Meio  2:  sais N6 (4 g/L), acrescidos de vitaminas N6 (1000 x) (1 ml/L), sacarose (20 g/L), caseínahidrolizada (100 mg/L), 2,4-D (0; 2; 4 mg/L), ANA (0; 3; 5 mg/L), água de coco (50 ml/L),phytagel (2,5 g/L) e pH 5,8; Meio 3:  igual ao  meio anterior  suplementado apenas com ANA (3mg/L); Meio 4: (100%) sais MS (4,30 g/L), acrescidos de vitaminas LS (1 ml/L), sacarose (60 g/L),inositol (100 mg/L), ANA (1 mM), phytagel (3,0 g/L), pH  5,8.RESULTADOS E DISCUSSÃOApós 6 semanas, calos foram observados em segmentos de eixos embrionários no meio 1, em todasas concentrações de 2,4-D testadas, com ênfase para a região do hipocótilo. Explantes cultivadosnas concentrações menores de 2,4-D (1 e 2 mg/L) apresentaram calos com aspecto branco ebrilhante, enquanto aqueles cultivados nas maiores concentrações (4 e 8 mg/L) apresentaram umaumento distinto de tamanho, boa formação de calos brancos, com partes amareladas, aspectogelatinoso, que secaram após alguns subcultivos. Janick (1986) afirmou que altas concentrações  de2,4-D mais água de coco estimulam a produção de calo e anulam a indução de embrião. Parasegmentos cotiledonares, nas concentrações menores  de 2,4-D, os explantes ficaram cobertos porcalos grandes, brancos e brilhantes, que ficavam amarelados, enquanto que nas concentrações maisaltas (4 e 8 mg/L) houve apenas a formação de massa calosa branca, seguida de escurecimento.Após 8 semanas, verificou-se o escurecimento e morte dos calos em todas as concentraçõesempregadas, o que poderia ser atribuído à combinação de 2,4-D com água de coco. Estes resultadosconcordam com os de Kononowicz  et al. (1984), empregando embriões zigóticos imaturos decacau, que observaram escurecimento e morte dos calos, em resposta à combinação de água de cocoe 2,4-D acima de 2 mg/L. Após 6 semanas no meio 2, notou-se a presença de raiz em segmentos dehipocótilo, no meio sem regulador de crescimento, e calos em segmentos radiculares. Estes efeitospodem ser devidos à presença de água de coco no meio de cultura. Legrand et al. (1984) concluíramque a água de coco favoreceu a rizogênese e calogênese em hipocótilo de plântulas de cacau, comemprego de meio básico, sem regulador de crescimento. Calos brancos friáveis foram observadosem todos os outros meios empregados, sendo estes mais pronunciados também na região dohipocótilo. Os meios que continham apenas ANA (3; 5 mg/L) apresentaram o maior número deraízes acompanhados de massa calosa enquanto os meios que continham ANA e 2,4-D (3; 2 mg/L)apresentaram calos brancos e raízes. Com cotilédones também houve indução de calos, queescureceram e secaram, não sendo evidenciado nenhum calo  embriogênico  nestes meios. Os calosforam subcultivados a cada 15 dias nestes meios e, após um mês, foram transferidos para meiolíquido, sem regulador de crescimento, a fim de estimular o aparecimento de estruturasembriogênicas. Ranch (1993) afirmou que a maturação em meio líquido facilitaria a prontaconversão de maior número de embriões somáticos. As culturas foram dispostas em frascosErlenmeyer, os quais foram mantidos sob agitação  contínua em agitador a 120 r/min, intercalandoluz e escuro. Após 3 dias nestas condições, observou-se aumento de tamanho dos explantes, bemcomo escurecimento dos mesmos. Após 15 dias nestas condições, as culturas foram transferidaspara um meio sólido, no caso o meio 3, empregando-se 3 mg/L de ANA, com o objetivo deestimular o aparecimento de estruturas embriogênicas. Apesar do escurecimento dos explantes, 3semanas após observou-se o aparecimento de calos amarelos, com aspecto friável. Estes resultadostambém foram obtidos por Figueira e Janick (1993), empregando tecido nucelar de cacau comoexplante. As culturas foram mantidas nesse meio durante 5 semanas sendo, em seguida, transferidaspara um meio de regeneração, o meio 4.  As culturas foram subcultivadas a cada 7 dias neste meioe, após um mês, observou-se que os calos permaneceram indiferenciados.CONCLUSÕES1. a região do hipocótilo do eixo embrionário de cupuaçu apresentou maior calosidade;2. as maiores concentrações de 2,4-D (4 e 8 mg/L) promoveram bom desenvolvimento desegmentos de eixos embrionários, acompanhados de calos brancos;3. ANA promoveu o aparecimento de raízes e formação de massa calosa;4. a  combinação de ANA e 2,4-D (3; 2 mg/L) promoveu o aparecimento de raízes e calos brancosem segmentos de hipocótilo;5. a água de coco favoreceu a rizogênese e calogênese em meio sem reguladores;6. o meio líquido favoreceu o aparecimento de calos friáveis.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASCALZAVARA, B.B.G.; MULLER, H. M.; KAHWAGE, O M. da C. Fruticultura Tropical: ocupuaçuzeiro, cultivo, beneficiamento e utilização do fruto. Belém: EMBRAPA/CPATU, 1984.p. 1-110. (Documento, 32).DAMIÃO FILHO, C. F. Cultura de tecidos de plantas: micropropagação. Jaboticabal: FUNEP,1995. 25 p.FIGUEIRA, A.; JANICK, J. Development of nucellar somatic embryos of Theobroma cacao.  ActaHorticulturae,  Wageningen, n. 336, p. 231-38,1993.JANICK, J. Embryogenics: the technology of obtaining useful products from the culture of asexualembryos. In: CROCOMO, O. J. (Ed.). Biotechnology of plants and microorganisms. 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O Cultivo do cupuaçuzeiro.Informativo SBF, Itajaí,  v. 4, n.1. 1985.

Respostas de tecidos de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) a concentração de auxina e meio líquido.

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