ALVES, V. M. C.

CARNEIRO, N. P.

GOMES, E. A.

GUIMARAES, C. T.

JARDIM, S. N.

LANA, U. G. P.

PURCINO, A. A. C.

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Genes Induzidos por Alumínio em Ápices de Raízes de umaCultivar de Arroz TolerantePrevious  Top Next  ELIANE A. GOMES, UBIRACI G. P. LANA, CLAUDIA T. GUIMARÃES, NEWTONP. CARNEIRO, SILVIA N. JARDIM, VERA M. C. ALVES e ANTÔNIO A. C.PURCINO*.   Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, CEP 35701-970, Sete Lagoas, MG*corsetti@cnpms.embrapa.br    Introdução  A toxidez pelo alumínio (Al3+) é um dos principais fatores que limitam a produtividadeagrícola em solos ácidos no Brasil. A maioria das plantas cultivadas são sensíveis àtoxidez de alumínio sob as condições dos solos tropicais, que inibe o crescimentoradicular e reduz a absorção de água e nutrientes do solo, comprometendo aprodutividade das culturas (Kochian, 1995). Durante o processo evolutivo, as espéciesvegetais desenvolveram diferentes mecanismos de adaptação à toxidez deste metal,ocasionando também diferentes níveis de tolerância. Dentre os mecanismos pelos quais asplantas toleram o Al3+, incluem a capacidade de algumas espécies em excluir o Al3+ doápice radicular (Silva et al., 2000) ou impedir a sua penetração nas raízes, quer pelaprodução de mucilagem (Miyasaka e Hawes, 2001), quer pela alcalinização da rizosfera,que torna o Al3+ insolúvel. A exsudação de ácidos orgânicos de baixo peso molecularpelas raízes é outro mecanismo que confere tolerância à fitotoxidade deste metal (Rengel,1996). Apesar da importância desse estresse, os mecanismos fisiológicos, bioquímicos emoleculares responsáveis pela tolerância à toxidez de Al3+ em plantas são ainda poucoentendidos (Delhaize e Ryan, 1995). Assim, a identificação dos genes induzidos por esseestresse pode ajudar na elucidação de tais mecanismos.  Dentre as gramíneas, o arroz (Oryza sativa) é uma espécie que se destaca por apresentartolerância relativamente elevada ao alumínio tóxico, podendo ser considerada uma fontede genes e alelos importantes para aumentar o patamar de tolerância a esse estresse. Oseqüenciamento completo do genoma do arroz aliado à colinearidade existente entre osgenomas das gramíneas (Gale e Devos,1998) amplia as possibilidades de utilização dasinformações existentes e facilita o ancoramento dos genes identificados entre as espéciesrelacionadas com o milho e sorgo. O objetivo deste trabalho foi identificar genesinduzidos pelo alumínio no ápice radicular de uma cultivar de arroz tolerante à toxidez dealumínio, utilizando a técnica de hibridização subtrativa seguida de PCR supressivo.   Material e Métodos  Sementes da cultivar CNA 6558-Fernandes foram germinadas em condições assépticaspor 5 dias, selecionadas por uniformidade e cultivadas em solução nutritiva por 24h(Magnavaca 1982). Após este período, renovou-se a solução nutritiva e metade dasplantas passou a ser cultivada em presença de 555 M de AlCl3. A outra metade foicultivada sem o Al3+. Após 1 hora de estresse, os ápices das raízes foram coletados eutilizados para extração dos RNAs mensageiros (RNAm), dos quais foram produzidas asbibliotecas de cDNAs "testadora" e "controle", segundo a técnica de hibridizaçãosubtrativa e PCR supressivo (Diatchenko et al.,1996).     Para a extração do RNAm utilizou-se o "Kit Quickprep micro RNAm purification"(Amersham Biosciences) e as bibliotecas de cDNA foram obtidas utilizando o PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit (Clontech Laboratories), conforme instruções dosfabricantes. Os produtos da segunda amplificação por PCR, obtidos das reações desubtração direta, foram clonados no vetor PCR 2.1 TOPO, utilizando-se o "Kit TOPOTA Cloning for Sequencing" (Invitrogen) e transformados em Escherichia coli. O DNAplasmidial das colônias selecionadas foi extraído pelo método de lise alcalina (Sambrooket al., 1989) e digerido com Eco RI para comprovação da presença de insertos. Asreações de seqüenciamento foram realizadas com o kit "Big Dye Terminator" v. 3.1(Applied Biosystems) de acordo com recomendações do fabricante e analisadas noseqüenciador ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). As seqüências obtidas foramprocessadas e comparadas com seqüências depositadas no GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando-se o programa BlastN (Altschul et al., 1997).   Resultados e Discussão   A Figura 1 apresenta os resultados obtidos em cada uma das etapas da técnica, incluindoos RNAs totais e mensageiros, cDNAs e os fragmentos amplificados, representando ostratamentos das plantas com e sem Al3+. Os clones das bibliotecas de cDNA foramseqüenciados, e as seqüências foram comparadas com aquelas depositadas no GenBank.      Os clones que apresentaram similaridade de seqüência com genes conhecidos foramclassificados em cinco classes distintas, estando envolvidos na estrutura celular (46%), naregulação da expressão gênica (17%), em estresses múltiplos (8%), no metabolismo (8%)e no transporte celular (8%) (Figura 2). A busca por possíveis mecanismos de ação destesgenes foi realizada e genes ligados a mecanismos de proteção ao estresse oxidativo foramobservados em arroz após 1 hora de estresse sob alumínio. Foram também identificadosgenes ligados à síntese de hormônios, manutenção da integridade da parede celular,organização do citoesqueleto e um transportador mitocondrial de fosfato. Por outro lado,não foram identificados clones com similaridade de seqüência aos genes envolvidos nasíntese de ácidos orgânicos.       Dentre os clones seqüenciados, 13% não mostraram similaridade com os dados doGenBank, sugerindo que eles podem representar novos genes que ainda não foramdescritos na literatura. Portanto, é possível que existam, nesta linhagem de arroz,mecanismos de tolerância ao alumínio ainda desconhecidos. A comprovação doenvolvimento dos genes já descritos e a identificação de novos genes certamentecontribuirão para incrementar os conhecimentos acerca dos mecanismos de tolerância aoalumínio em arroz e em outras gramíneas como milho e sorgo. Adicionalmente, tais genespoderão ser incorporados aos programas de melhoramento, utilizados na piramidação demecanismos e em eventos de transformação genética para elevar o patamar de tolerânciaentre as gramíneas cultivadas.    Literatura citada   ALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T.L.; SCHÄFFER, A.A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.;MILLER, W.; LIPMAN, D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation ofprotein database search programs. Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389-3402, 1997.   DELHAIZE, E.; RYAN, P. Aluminum toxicity and tolerance in plants. Plant Physiology,v. 107, p. 115-121, 1995.   DIATCHENKO, L.Y.F.C.; LAU, A.P.; CAMPBELL, A.; CHENCHIK. F.; MOQADAN,B.; HUANG, S.; LUKYANOV, K.; LUKYANOV, N.G.; GURSKAYA, E.;SVERDLOV. P.D. SIEBERT. Supression subtractive hybridization: a method forgenerating differentially regulated of tissue-specifc cDNA probes and libraries.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,v.93, p.6025-6030, 1996.   GALE, M. D. e DEVOS, K. M. Comparative genetics in the grasses. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America, v. 95, p.1971-1974,1998   KOCHIAN, L.V. Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants.Annual Review Plant Physiology, v. 46, p. 237-260, 1995.   MAGNAVACA, R. 1982. Genetic variability and the inheritance of aluminumtolerance in maize (Zea mays, L.). Lincoln: University of Nebraska, 135 p. TeseDoutorado.   MIYASAKA S., HAWES M. C. Possible role of root border cells in detection andavoidance of aluminum toxicity. Plant Physiology, v.125, p.1978-1987, 2001.   RENGEL, Z. Uptake of aluminium by plant cells. 1996. New Phytologist, v.134, p.389-406, 1996.   SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratorymanual. 2. ed. Cold spring harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.         

Genes induzidos por alumínio em apices de raízes de uma cultivar de arroz tolerante.

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