Regras de segurança em laboratórios; Extração de DNA; Extração de RNA; Quantificação em espectrofotômetro; Reação em cadeia da polimerase (PCR); Enzimas de restrição; Eletroforese de ácidos nucléicos; Seqüenciamento; Síntese de DNA complementar (CDNA

GOUVEIA, J. J. de S.

REGITANO, L. C. de A.

A extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é o primeiro passo para a realização da maioria das metodologias de biologia molecular

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

			2. EXTRAÇÃO DE DNAJoão José de Simoni GouveiaLuciana Correia de Almeida RegitanoA extração dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) é o primeiro passo para arealização da maioria das metodologias de biologia molecular. Pode-se obter DNA apartir de inúmeros tipos de tecidos e células, e existe uma infinidade de protocolospara realização de tal procedimento. A escolha do protocolo de extração de DNAdependerá de diversos fatores como: tipo de tecido a ser utilizado, grau de pureza ede integridade necessária para a aplicação em que o DNA será utilizado (PCR,seqüenciamento, clonagem gênica, etc.) (Bartlett, 2003).O primeiro relato sobre isolamento de DNA data de 1869 e foi realizado porFriedrich Miescher, a partir de leucócitos presentes em pus. Miescher lisou estascélulas com uma solução alcalina e precipitou o material nuclear com solução salina.Este material nuclear que posteriormente seria conhecido como DNA, foi chamadode nucleína (http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/historico2004.pdf, http://www.dnai.org ).Basicamente, o processo de extração de DNA consiste em duas etapas. Aprimeira etapa é a extração propriamente dita e consiste no rompimento dasmembranas celulares (e conseqüente exteriorização do DNA). A segunda faseconsiste na purificação do DNA em solução, ou seja, “retirada” dos outroscomponentes celulares da solução (restos de membrana, proteínas, RNA) (Romano,1999).O rompimento das membranas celulares geralmente é feito com detergentes(SDS ou CTAB). A utilização de agentes caotrópicos como o tiocianato de guanidina			impede o DNA de se ligar nas outras moléculas, facilitando sua separação nasegunda fase do processo. Após esta fase, deve-se separar o DNA dos outroscomponentes celulares. Isto é feito por meio da adição de substâncias que façamcom que a solução torne-se heterogênea e que o DNA fique dissolvido em apenasuma das fases, como por exemplo, quando se utiliza fenol para desnaturar asproteínas, ficando o DNA na fase aquosa e as proteínas na interface entre as fasesorgânica e aquosa. Uma alternativa à utilização dos solventes orgânicos como ofenol é fazer a separação das proteínas utilizando altas concentrações de sal(salting-out). Após separar o DNA dos outros componentes celulares, pode-seproceder uma precipitação do DNA para garantir a máxima pureza do material, estaprecipitação geralmente faz-se utilizando álcool (etanol ou isopropanol) que, empresença de cátions monovalentes, promove uma transição estrutural na moléculade ácido nucléico, resultando em agregação e precipitação (Regitano, 2001;Azevedo, 2003; http://www.etall.hpg.ig.com.br/cursopcr.html).Os protocolos abordados neste capítulo são utilizados na rotina do laboratóriode Biotecnologia Animal do Centro de Pesquisa de Pecuária do Sudeste e sãoadaptações dos protocolos descritos em Regitano (2001).O objetivo deste capítulo é fazer com que o aluno entenda os princípios desteprocesso, a finalidade de cada reagente em um protocolo de extração de DNA e, apartir daí, possa utilizar e adaptar os protocolos já existentes de acordo com suanecessidade e disponibilidade de reagentes.			2.1. Extração de DNA de LeucócitosA) Obtenção de Leucócitos1. Coletar 5mL de sangue em tubos contendo EDTA potássico [50L deEDTA(K3) a 15%]O EDTA é uma substância anticoagulante. Existem outras substâncias comesta finalidade (citrato e heparina), porém se o DNA for utilizado para PCR não sedeve utilizar heparina, pois esta substância interfere na atividade da enzima TaqDNA polimerase.2. Transferir 2,5 mL do sangue para um tubo Falcon de 15mL3. Adicionar 10mL de Solução A e vortexar até homogeneizar4. Centrifugar por 10 min a 700 xg5. Dispensar o sobrenadante6. Ressuspender o pellet em 5mL de Solução A7. Vortexar até dissolver completamente o pellet8. Centrifugar por 10 min a 700 xg9. Repetir os passos 4 – 9 até obter somente as células brancas (o pelletdeve estar branco cremoso).Resíduos de hemoglobina inibem a reação de PCR10. Ressupender o pellet em 500L de Solução A e transferir para microtubosde 1,5mL11. Centrifugar 5 min a 16.000 xg e descartar o sobrenadante.			As células brancas assim preparadas podem ser armazenadas entre -20°C e -80°CB) Extração e purificação do DNA 1. Ressuspender o pellet em 500L de Solução B 2. Vortexar até o pellet desprender do fundo do tubo 3. Incubar a 55°C por 4-6 horas (ou overnight). Vortexar periodicamentedurante a incubação para que a dissolução do pellet seja completaA Solução B contém Tris HCl (pH 8,0) que é uma solução tampão, cujafinalidade é manter o pH constante. Como o pH ótimo para a ação de DNasesendógenas é por volta de 7,0, este reagente ajuda a evitar a ação destas nucleases.O SDS é um detergente iônico forte, cuja função é romper as membranas celulares,o EDTA age quelando íons Mg2+ e Ca2+ (que são co-fatores de diversas enzimasnucleares como as DNases) e a proteinase K hidrolisa as proteínas.Se houver disponibilidade de um bloco aquecido com agitador (termomixer),deve-se deixar as amostras agitando durante a incubação. 4. Adicionar 210L de TE (pH 7,6) e 240L de NaCl 5MO NaCl fará com que as proteínas precipitem por excesso de íons. O TE é umtampão. 5. Agitar os tubos por inversão até formar pequenos coágulos 6. Incubar em gelo por 10 min 7. Centrifugar por 15 min a 16.000xg			 8. Recolher o sobrenadante dividindo-o em dois microtubos de 1,5mLlimpos (máximo de 500L de sobrenadante por tubo) 9. Adicionar 1mL de etanol 100% (absoluto) gelado em cada tubo emisturar por inversãoÉ fundamental que o volume de etanol corresponda à, no mínimo, 02 vezeso volume da solução para que a precipitação do DNA seja eficiente.Alternativamente, pode-se utilizar 01 volume de isopropanol à temperaturaambiente.O Álcool torna o meio muito hidrofóbico para o DNA, fazendo com que eleprecipite sobre sua própria estrutura. 10. Centrifugar por 15 min a 16.000xg 11. Descartar o sobrenadante 12. Secar em papel 13. Adicionar 500L de etanol 70% geladoO álcool 100% faz com que precipitem muitos sais juntamente com o DNA,além de dificultar a ressuspensão do DNA, por isso utiliza-se uma “lavagem” comálcool 70%. 14. Centrifugar por 5 min a 16.000xg 15. Descartar o etanol e secar o pellet 16. Adicionar 250L de TE+RNase (10g de RNase por mL de amostra) eincubar por 1h a 37°C			Este protocolo isola juntamente com o DNA uma quantidade considerável deRNA, por isso o tratamento com RNase se faz necessário para remover estecontaminante.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE UTILIZANDO O KIT GFXMárcia Cristina de Sena Oliveira1. Colocar 300 µL de sangue e 900 µL de solução de lise em microtubo de 1,5mL2. Homogeneizar, centrifugar a 21.000 xg por 5 minutos e descartar osobrenadante3. Homogeneizar e adicionar 500 µL de solução de extração4. Incubar por 5 minutos à temperatura ambiente e transferir o conteúdo dotubo para a coluna de extração acoplada a um tubo coletor5. Centrifugar a 5.000 xg por 1 minuto6. Adicionar à coluna 500 µL de solução de extração e centrifugar a 5.000 xgpor 1 minuto7. Adicionar à coluna 500 µL de solução de lavagem e centrifugar a 21.000 xgpor 3 minutos8. Transferir a coluna para um microtubo de 1,5 mL, limpo e livre de DNAses9. Adicionar 100 µL de água bidestilada, autoclavada e aquecida a 70ºC.Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. Centrifugar a 5.000 xg por 1minuto

Extração de DNA.

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa