ALVES, J. D.

CARNEIRO, N. P.

GOMES, E. A.

GUIMARAES, C. T.

JARDIM, S. N.

LANA, U. G. P.

PINTO, A. C.

PURCINO, A. A. C.

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Genes Induzidos por Tratamento com Cálcio em Raízes do Milho(Zea mays L.)Saracura 'BES-4154', em Condições de HipoxiaPrevious  Top Next   ANNE C. PINTO(1*), JOSÉ D. ALVES(1), NEWTON, P. CARNEIRO(2), ELIANE A.GOMES(2), CLAUDIA T. GUIMARÃES(2) UBIRACI G. P. LANA(2), SILVIA N.JARDIM(2) e ANTÔNIO A. C. PURCINO(2)   (1)Universidade Federal de Lavras, CP 37, CEP 37200-000, Lavras, MG(*)anecybele@yahoo.com.br (2) Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, CEP 35701-970, SeteLagoas, MG   Introdução  O alagamento e a submersão são fatores de estresses abióticos que afetam a vegetação e,juntamente com a seca, salinidade e altas temperaturas constituem os principaisdeterminantes da distribuição das espécies vegetais no mundo (Visser et al., 2003). Essasituação provoca um ambiente hipóxico ou anóxico ao redor da raiz, que é o principalfator determinante dos efeitos adversos do alagamento, uma vez o oxigênio é o aceptorfinal de elétrons na rota de fosforilação oxidativa que gera ATP (Dennis et al., 2000). Asmitocôndrias sofrem com a deficiência de oxigênio antes de qualquer outra organela.Experimentos realizados por Subbaiah et al. (1998), com cultura de células em suspensãode milho transferidas de um meio aeróbico para outro anaeróbico, demonstraram que osíons cálcio liberados da mitocôndria para o citossol participam na sinalização dadiminuição do oxigênio, levando à expressão de genes relacionados com a anaerobiose. Aanaerobiose resulta em alterações da expressão gênica em âmbito transcricional,traducional e pós-traducional (Sachs et al., 1980). A união dos sinais citoplasmáticos paraa ativação e repressão de genes no núcleo direciona a célula para a divisão, diferenciaçãoou morte. Muitos desses sinais na rota de transdução de sinal são ativados pela elevaçãointracelular do cálcio (Mckinsey et al, 2002). Quando o canal de cálcio é bloqueado, osgenes induzidos por anoxia são reprimidos e a sobrevivência das plântulas e células emambiente pós-anóxico fica comprometida (Subbaiah e Sachs, 2003). Vários trabalhos jáforam realizados com o milho 'BRS-4154' Saracura buscando avaliar sua tolerância ahipoxia e a influência do cálcio no aumento dessa sobrevivência. Essa variedade possui,como principal característica agronômica, tolerância a períodos intermitentes deinundação do solo e foi lançada no mercado pela Embrapa Milho e Sorgo, por terapresentado aumentos em alguns parâmetros, relacionados com a produção, emcondições de deficiência de oxigênio no solo (Parentoni et al., 1997). Nenhum estudo naárea molecular envolvendo esta variedade foi feito e, por isso, o interesse em se trabalharnesta área com esta cultivar. A estratégia utilizada para a obtenção de genes relacionadosà tolerância ao alagamento influenciado pelo cálcio foi a técnica de hibridação subtrativa ePCR supressivo.   Material e Métodos  Sementes do ciclo 14 de seleção massal, sob alagamento intermitente do milho Saracura,foram germinadas e submetidas ao alagamento na presença ou não de cálcio (CaCl2) a0,75% (p/v). Para diminuir a pressão de oxigênio no tubo de germinação, tornando oambiente hipóxico, fez-se borbulhamento com nitrogênio gasoso (3% v/v O2 em N2) por3 minutos (1 L.min-1) e os tubos foram hermeticamente vedados. Após dois dias deestresse, o ápice primário da raiz (5 mm) e o material restante desse órgão foramcoletados, separadamente, armazenados em nitrogênio líquido e posteriormente estocadosa -80ºC. Os tratamentos foram ápice de raiz com cálcio, ápice de raiz sem cálcio, raizcom cálcio e raiz sem cálcio. Para a extração do RNAm, utilizou-se o "Kit Quickprepmicro RNAm purification" (Amersham Biosciences), segundo as instruções do fabricante.   Para a obtenção das bibliotecas de cDNA , foi utilizado o PCR-SelectTM cDNASubtraction Kit (Clontech Laboratories) conforme instruções do fabricante. Os produtosda segunda amplificação por PCR, obtidos das reações de subtração direta, foramclonados no vetor PCRR 2.1 TOPO, utilizando-se o "Kit TOPO TA Cloning forSequencing" (Invitrogen). Para a extração dos plasmídeos, foi utilizado o método de lisealcalina descrito por Sambrook et al. (1989). Esses plasmídeos foram seqüenciadosutilizando-se o "kit DYEnamic ET Dye Terminator" (Amershan Pharmacia), 3,2 M de"primer" pUC/M13 direto ou reverso, separadamente. As seqüências foram comparadascom seqüências depositadas no banco de dados "Genbank"(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando-se o programa Blast N (Altschul et al., 1997).Para verificar a expressão desses clones, foi feita a extração de DNA de folhas do milhoSaracura segundo metodologia desenvolvida por Saghai-Maroof et al. (1984). Esse DNAfoi digerido com enzimas de restrição e transferido para membrana de náilon, de acordocom metodologia de Southern (1975). As membranas foram hibridadas com sondasmarcados com fosfatase alcalina.   Resultados e Discussão     Pela análise visual, observou-se que as plântulas submetidas a quatro dias degerminação, sob influência de cálcio, apresentaram redução acentuada no crescimento emrelação às plântulas germinadas sem cálcio. As plântulas não apresentaram sinal de injúrianeste período e sobreviveram a 48 h de estresse. Utilizando a técnica de hibridaçãosubtrativa e PCR supressivo, 4 clones (Tabela 1) representando fragmentos de genesinduzidos por hipoxia sob influência do cálcio proveniente do ápice da raiz e 13 clones(Tabela 2) da biblioteca de raiz do milho Saracura foram gerados. A técnica de hibridaçãosubtrativa por supressão detectou genes expressos diferencialmente sob hipoxia,influenciados pelo cálcio. A Figura 1 mostra a provável relação entre as proteínasencontradas na biblioteca de raiz de plântulas de milho submetidas a hipoxia sob ainfuência de cálcio. Dentre as proteínas identificadas na raiz, pode-se citar a mioglobina,cuja cadeia polipeptídica tem regiões muito similares às cadeias da hemoglobina, proteínade transporte de oxigênio (Dordas et al., 2003). A mioglobina provavelmente transportaoxigênio para a mitocôndria, uma vez que se trata de um ambiente de baixa pressão deoxigênio e, sob esta condição, não ocorre inibição total da respiração aeróbica. A dineína,que provavelmente ativa os canais de cálcio ou atua no recrutamento de organelas, queacumulam cálcio, para locais que mais necessitam deste elemento (Thion et al., 1996). Aparacaspase faz parte da rota de morte celular programada (Ameisen, 2002), promovendoa formação de aerênquima, que facilita a difusão do oxigênio. A proteína-ligante FK506,que pode ser um receptor de hormônio que atua na transcrição de genes ou atua na via detransdução de sinal (Pérez-Pérez et al., 2004) e, finalmente, a basigina, que é umaglicoproteína transmembrana que faz parte da constituição do complexo do poro nuclear(Yoshida et al., 2000). Este complexo permite a passagem de proteínas do citossol para onúcleo e vice-versa, atuando na transcrição de genes. Dentre os clones provenientes doápice primário da raiz, destaca-se a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, proteínasintetizada na raiz durante condições anóxicas e conhecida como polipeptídeo anaeróbico(Manjunath e Sachs, 1997). Essa proteína é requerida para continuidade da glicólise,tornando-se essencial na resposta anaeróbica pela planta para reposição de ATP pela rotaglicolítica. Além desses, genes do projeto de mapeamento do genoma de milho que,apesar da função não revelada ainda, podem ser genes importantes que atuam na maiorsobrevivência da planta ao estresse hipóxico influenciado pelo cálcio. De alguma forma,todas as proteínas estão relacionadas e atuam na tentativa de promover uma maiorsobrevivência para a plântula em hipoxia sob influência do cálcio. Esses genes poderãoser transferidos para outras variedades de milho de interesse econômico, por meio detransformação. Como algumas seqüências dos genes de raiz do milho Saracuraapresentaram identidade com genes de Homo sapiens, foi feita uma análise, utilizando-seda metodologia de "Sourthern-blot", para a confirmação da presença desses genes nomilho Saracura. Foram escolhidos cinco cDNAs, como sonda, provenientes de raiz, queapresentaram identidade com mioglobina, dineína, basigina, paracaspase e proteína liganteFK506. Como controle positivo, utilizou-se a sonda gliceraldeido-3-fosfato desidrogenasedo milho, presente no material proveniente do ápice da raiz. Pelo sinal positivoapresentado pela hibridação das sondas, foi possível confirmar a presença destasseqüências no milho Saracura (Figura 2).   Literatura citada   ALTSCHUL, S.F.; MADDEN, T.L.; SCHÄFFER, A.A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.;  MILLER, W. LIPMAN, D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of  protein database search programs, Nucleic Acids Research, v. 25, p. 3389-3402,  1997.   AMEISEN, J. C. Origin and evolution of programmed cell death. Cell Death Differentiation, London, v. 9, n. 4, p. 367-393, Apr. 2002.   DENNIS, E. S.; DOLFERUS, R.; RAHMAN, M.; Wu, Y.; HOEREN, F. U.; GROVER, A.;  ISMOND, K. P.; GOOD, A. G.; PEACOCK, W. J. Molecular strategies for improving  waterlogging tolerance in plants. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 51, n. 342, p.  1-15, Jan. 2000.   DORDAS, C.; RIVOAL, J.; HILL, R. D. 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Genes induzidos por tratamento com cálcio em raízes do milho (Zea mays L.) Saracura 'BRS-4154', em condições de hipoxia.

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Genes induzidos por tratamento com cálcio em raízes do milho (Zea mays L.) Saracura 'BRS-4154', em condições de hipoxia.

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