BENBADIS, A. K.

LAMEIRA, O. A.

LEDO, A. da S.

LEDO, C. A. da S.

MENEZES, I. C. de

OLIVEIRA, M. do S. P. de

Portuguese

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

468Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 23, n. 3, p. 468-472, dezembro 2001______________________________________________________________1  (Trabalho 271/2000). Recebido: 19/12/2000. Aceito para publicação: 04/10/2001. Parte da tese de Doutorado do primeiro autor, financiada comrecursos da Embrapa Amazônia Oriental/JICA.2 Engª Agrª D.Sc., pesquisadora da Embrapa-Acre, caixa postal 392, CEP. 69900-000, Rio Branco-AC, e-mail: analedo@cpafac.embrapa.br.3 Eng° Agr° D.Sc., pesquisador da Embrapa Amazônia Oriental, caixa postal 48, CEP 66017-970, Belém-PA.4 Eng° Agr° PhD., professor visitante do Departamento de Fitotecnia da UFC, Av. Mister Hull, s/n, CEP. 60020-181, Campus do Pici, Fortaleza-CE.5 Engª Agrª M.Sc., Técnica de Nível Superior da Embrapa Amazônia Oriental.6 Eng° Agr° M.Sc., doutorando da Universidade Federal de Lavras, Caixa Postal 37, CEP 37200-000, Lavras-MG.7 Engª Agrª M.Sc., pesquisadora da Embrapa Amazônia Oriental.CULTURA IN VITRO DE EMBRIÕES ZIGÓTICOS DE AÇAIZEIRO1ANA DA SILVA LEDO2 , OSMAR ALVES LAMEIRA3 , ABDELLATIF K. BENBADIS4 ,ILMARINA CAMPOS DE MENEZES5 , CARLOS ALBERTO DA SILVA LEDO6 ,MARIA DO SOCORRO PADILHA DE OLIVEIRA7RESUMO- Este trabalho teve como objetivo estabelecer o protocolo para a produção de plântulas in vitro a partir da conversão deembriões zigóticos de açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.). Os embriões zigóticos maduros foram excisados sob condições assépticas,a partir de sementes obtidas de frutos maduros, e cultivados em tubos de ensaio com 10 mL de meio MS modificado pela presença de0,17 g.L-1  de NaH2PO4, com 0,6 % de ágar, 0,25 %  de carvão ativado e 3 %  de sacarose. Foram testadas diferentes combinações de ANA(0,54; 2,68 e 5,37 µM) e BAP (0,44; 1,11; 1,55 e 2,22 µM) e uma testemunha adicional. Em média, os tratamentos constituídos dacombinação de ANA e BAP foram superiores à testemunha para todas as variáveis avaliadas. As concentrações de 0,54 e 2,68 µM deANA promoveram, em média, maior formação de plântulas normais quando comparado com 5,37 µM de ANA. O maior comprimento daparte aérea foi induzido pela presença de 2,68 µM de ANA combinado com 1,11; 1,55 e 2,22 µM de BAP.  Não foram verificadasdiferenças significativas entre as concentrações de ANA e BAP para a percentagem de conversão de embriões e número de raízes porplântula.Termos para indexação: conversão in vitro, Euterpe oleracea, meios de cultura, regulador de crescimentoIN VITRO CULTURE OF ASSAI PALM ZYGOTIC EMBRYOSABSTRACT- This work had as objective to establish protocol for the production of seedlings in vitro from of the conversion of assaipalm zygotic embryos (Euterpe oleracea Mart.).  The mature zygotic embryos obtained of seeds of mature fruits were excised underaseptic conditions,  and cultivated  in rehearsal tubes with 10 mL of a MS medium modified by the presence of 0,17 g.L-1 of NaH2PO4,with agar 0,6%, 0,25% activated charcoal and 3% sucrose. Different combinations of NAA were tested (0,54; 2,68 and 5,37 µM) andBAP (0,44; 1,11; 1,55 and 2,22 µM) and a treatment without growth regulator. On the average, the constituted treatments of ANA  andBAP were superiors the to a treatment without growth regulator to all the parameters. The concentrations of 0,54 and 2,68 µM of NAApromoted, on the average, larger formation of normal seedlings when compared with 5,37 µM NAA. The presence of 2,68 µM NAAplus 1,11; 1,55 and 2,22 µM BAP  was induced largest shoot length.  Significant differences were not verified between NAA and BAPconcentrations  for the number of roots/seedlings.  The obtained results allowed verifying that an addition of NAA and BAP in theculture medium was necessary to the conversion of mature zygotic embryos in both vigorous and normal seedlings.Index terms: in vitro conversion, Euterpe oleracea,  culture media, growth regulatorINTRODUÇÃOO açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) é uma palmeiratipicamente tropical e está distribuída geograficamente naAmérica do Sul, principalmente no Brasil, nos Estados do Pará,Amazonas, Acre, Amapá e Maranhão (Kahn, 1997). É uma plantadominante em áreas de mata do estuário amazônico, fazendoparte da vegetação de terra firme, várzea e igapó, sendo maiscomum em áreas de várzeas, onde chega a formar populaçõeshomogêneas (Jardim et al., 1995).Dentre as diversas espécies nativas da região Amazônica,o açaizeiro destaca-se com grande potencial de exploraçãosocioeconômico, visto que pode ser utilizado integralmente paraa exploração econômica de frutos, palmito e celulose. De seusfrutos, obtém-se um suco denominado de açaí, que tem grandeaceitação no mercado regional e, atualmente, devido ao seuexcelente valor nutritivo e calórico, vem conquistando osmercados nacional e internacional, sendo comercializado “innatura”, como suco gelado, na fabricação de geléias, sorvetes epicolés (O Sabor..., 1992).A propagação in vitro constitui-se numa ferramenta degrande importância para plantas com dificuldade de seremmultiplicadas vegetativamente (Robles, 1983), como é o casodas palmeiras e, mais especificamente, do açaizeiro, onde opegamento de perfilhos é menor que 1 %. Esta técnica temdespertado interesse por facilitar a produção de mudas de material469Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 23, n. 3, p. 468-472, dezembro 2001CULTURA IN VITRO DE EMBRIÒES ZIGÓTICOS DE AÇAIZEIROelite em escala comercial, por produzir plantas livres de patógenose acelerar programas de melhoramento que, no caso de palmeiras,são demorados e complexos em virtude do longo ciclo, hábito decrescimento e ausência de métodos convencionais de propagaçãovegetativa em virtude da ausência de câmbio vascular emmonocotiledôneas.Dentre as técnicas de cultura de tecidos, a cultura deembriões, por tentar reproduzir in vitro o normal desenvolvimentode embriões, apresenta-se como uma ferramenta para o controleda embriogênese, o resgate de embriões interespecíficos, quandoapresentam alguma incompatibilidade, a produção de haplóides,a quebra de dormência e a produção de plântulas assépticas,além de elucidar alguns problemas como nutrição do embrião noóvulo entre outras aplicações (Collins & Grosser, 1984; Hu &Ferreira, 1998).Conforme relatado por Hu & Ferreira (1998), embriõesexcisados no estádio maduro ou próximo a este são quaseautotróficos e, em geral, dependendo da espécie, não hánecessidade de suplementação de fonte de energia, podendogerminar e crescer num meio inorgânico, e os reguladores decrescimento tornam-se dispensáveis.Os objetivos do presente trabalho foram avaliar o efeitoda adição de ANA e BAP no meio de cultura e estabelecer umprotocolo para a conversão in vitro de embriões zigóticos deaçaizeiro.MATERIAL  E  MÉTODOSO estudo foi conduzido no Laboratório de RecursosGenéticos e Biotecnologia da Embrapa Amazônia Oriental, emBelém-Pará. Frutos maduros, obtidos da coleção de germoplasmade açaizeiro da Embrapa Amazônia Oriental e com peso médio de2,35 g, foram lavados em água corrente e submetidos aodespolpamento em água a 40ºC. As sementes foram desinfestadasem câmara de fluxo laminar, com a imersão em álcool etílico a 70 %por dois minutos e, em seguida, em solução de NaClO a 2 % por20 minutos sob agitação e, posteriormente, foram lavadas quatrovezes em água destilada e autoclavada.Os embriões zigóticos, excisados de sementes assépticassob câmara de fluxo laminar, foram inicialmente inoculados, emtubos de ensaio contendo 10 mL de meio de cultura MS(Murashige & Skoog, 1962), modificado pela ausência devitaminas e aminoácidos, suplementado com 0,6 % de ágar e 0,25% de carvão ativado. O pH do meio de cultura foi ajustado para5,8 e, em seguida, submetido à esterilização autoclave a 120ºCdurante 15 minutos.As culturas foram mantidas em sala de crescimento comtemperatura de 26º ± 2ºC, umidade relativa do ar média em tornode 70 % e fotoperíodo de 16  horas de  luz branca  fria sob 52µmol.m-2.s-1 de irradiância/ oito horas de escuro.Aos três dias da inoculação, foi realizada a avaliaçãoquanto às percentagens de contaminação por microorganismose de oxidação. Em seguida, os embriões foram transferidos paratubos de ensaio com 10 mL de meio MS modificado pela presençade 0,17 g.L-1  de NaH2PO4, com 0,6 % de ágar, 0,25 %  de carvãoativado e 3 %  de sacarose, suplementado com diferentescombinações de ácido naftalenoacético (ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP), ajustando-se o pH a 5,8 antes daautoclavagem.Foram testadas três concentrações de ANA (0,54; 2,68 e5,37 µM) combinadas com quatro de BAP (0,44; 1,11; 1,55 e 2,22µM) e uma testemunha adicional (sem regulador de crescimento),perfazendo um total de 13 tratamentos.O delineamento estatístico utilizado foi o inteiramentecasualizado, com quatro repetições. Cada unidade experimentalfoi constituída de 10 tubos de ensaio, contendo um explantecada.Aos 10 dias após a inoculação, avaliou-se a percentagemde conversão de embriões zigóticos em plântulas e, aos 48 dias,a percentagem de plântulas anormais, o comprimento da parteaérea (mm) e o número de raízes por plântula. Como plântulasanormais, foram consideradas aquelas que apresentavamausência ou crescimento atrofiado da parte aérea, do sistemaradicular atrofiado e do haustório. As variáveis foram submetidasà análise de variância pelo teste F e as médias comparadas peloagrupamento de Skott & Knott, em nível de 5% de probabilidade.RESULTADOS  E  DISCUSSÃONa primeira semana de cultura, observaram-se ointumescimento dos embriões zigóticos e o início da expansãoda lâmina cotiledonar na região basal, estrutura correspondenteao haustório que, devido a sua atividade digestiva, substituiprogressivamente o albúmen no processo de germinação. Ostecidos do nó cotiledonar apresentavam-se intumescidos eavermelhados. Aos 14 dias, foi observada a emissão da radículae do coleóptilo cotiledonar a partir da região apical periférica. Naterceira semana, verificaram-se a formação do pecíolo a partir docoleóptilo, o início da expansão do limbo foliar e a emissão deraízes secundárias (Figura 1A). Nas plântulas normais, observou-se o rápido crescimento do haustório que, aos 60 dias, seapresentava com coloração branca e consistência esponjosa,sendo que, nas plântulas anormais se apresentava atrofiado(Figura 1B).A análise de variância detectou efeitos significativos dainteração “ANA x BAP” para o comprimento  da  parte  aérea  (P= 0,01) e  do  ANA para  a  percentagem  de  plântulas  normais (P=  0,05) (Tabela 1).O contraste “Fatorial vs Testemunha” (y = xF - xTe) foisignificativo, sendo que os valores da estimativa do contrastepara todas as variáveis avaliadas foram  positivos (Tabela 1), ouseja, em média, os tratamentos constituídos da combinação deANA e BAP foram superiores à testemunha.Observa-se, na Figura 2A, que as maiores percentagensde conversão de embriões zigóticos e formação de plântulasnormais foram verificadas, em média, em todos os tratamentosconstituídos da presença de ANA e BAP quando comparadocom a testemunha. Estes resultados concordam com Lemos et al.(1999), que observaram apenas 25 % de conversão de embriõesde Euterpe oleracea Mart., com a formação de apenas 12,5 % deplântulas normais na ausência de ANA e BAP. Llano-Agudeloet al.(1995) obtiveram 85,7 % e 83,3 % de conversão de embriõeszigóticos maduros de Persea americana Mill cv. Americana emmeio MS suplementado com 0,3 mg.L-1 de AIB e 1,0 mg.L-1 deKIN e 0,1 mg.L-1 de AIB e 0,3 mg.L-1 de KIN, respectivamente.Entretanto, Yokoo et al. (1992) obtiveram a formação de plântulas470Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 23, n. 3, p. 468-472, dezembro 2001FIGURA 1 - Conversão de embriões zigóticos de Euterpe oleracea Mart. A- início da expansão do limbo foliar e  de raízes secundárias;B- plântulas normais e anormais aos 60 dias de cultura. Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA, 2000.TABELA 1- Resumo da análise de variância para médias da percentagem de conversão de embriões zigóticos (%CEZ), da percentagemde plântulas normais (%PN), do comprimento da parte aérea (CPA) e do número de raízes (NR) de plântulas de Euterpeoleracea Mart., em meio MS suplementado com diferentes concentrações de ANA e de BAP. Embrapa AmazôniaOriental, Belém-PA, Brasil, 2000.Fontes de Variação G.L. Quadrados Médios   %CEZ %PN CPA(mm) NR ANA 2 118,75ns 3249,87** 48,47ns  0,1600ns BAP 3 190,97ns   395,32ns 48,78ns 0,1929ns ANA x BAP 6 257,64ns   362,22ns   106,15* 0,0896ns Fatorial vs Testemunha 1     5020,67**    2734,64*   243,75*     2,1140* Resíduo 39       150,64      272,24     27,18     0,2069 Estimativa do contraste        442,50 326,57     97,50     9,08 CV (%)          13,78   23,38     17,87    18,26  * - significativo em nível de 5 % pelo teste F ; ** - significativo ao nível de 1 % pelo teste F;  ns - não significativoA. DA S. LEDO  et al.471Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 23, n. 3, p. 468-472, dezembro 2001completas, a partir de embriões zigóticos de Euterpe oleraceaMart. e do híbrido Euterpe oleracea x Euterpe edulis, em meioMS modificado na ausência de reguladores de crescimento.Conforme Hu & Ferreira (1998), embriões excisados noestádio maduro ou próximo a este são quase autotróficos e, emgeral, dependendo da espécie, não há necessidade desuplementação de fonte de energia, e os reguladores decrescimento tornam-se dispensáveis. Entretanto, no presentetrabalho, ficou evidenciada a necessidade de enriquecimento domeio com reguladores de crescimento considerando que, naausência destes, obteve-se 55 % de conversão de embriões e aformação de 45,42 % de plântulas anormais (Figuras 2A e 2B).Provavelmente, além da espécie e do estádio de desenvolvimentodos embriões, o nível endógeno de fitormônios nos explantesFIGURA 2- (A)- percentagem de conversão de embriões; (B)-percentagem de plântulas normais, (C)-comprimento médio da parte aérea (mm), (D)-número médio de raízes/plântula, em resposta àpresença e ausência de ANA e BAP no meio decultura MS na conversão in vitro de embriõeszigóticos maduros de Euterpe oleracea Mart.Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA, 2000.                            100 95 95                          90 77,595                             100 9080                            90 1009055050100150% CEZ0,44 1,11 1,56 2,22BAP(uM)0,54      2,68   5,37test.                            7 7 ,1 8 a                             8 4 ,0 6 a                        4 6 ,6 7 b 4 5 ,402 04 06 08 01 0 0% PN0 ,5 4 2 ,6 8 5 ,3 7 te s t.A N A  (u M )               28,22aB25,95aB23,97aA                    29,5bB33,32aA28,55bA                    31,37aA36,95aA25,02bA                    30,45bA38aA26,57bA21,670102030405060CPA (mm)0,44 1,11 1,56 2,22BAP (uM )0,542,68    5,37test.                        2,62,282,65                     2,25 2,562,45                     2,52,452,67                    2,79 2,522,851,79012345NR0,44 1,11 1,55 2,22BAP (uM)0,542,68   5,37test.ANA (µM) (A)     (B)  (C) ANA (µM) (D)ANA (µM) deve ser considerado na cultura de embriões.As concentrações de 0,54 e 2,68 µM de ANA promoveram,em média, maior formação de plântulas normais quandocomparado com o nível de 5,37 µM de ANA (Figura 2B). Elevadasconcentrações de auxinas induzem, predominantemente, aformação de raízes em detrimento da formação da parte aérea,conforme relatado por Skoog & Miller (1957), podendo este fatoter contribuído para a maior conversão de embriões em plântulasanormais em elevada concentração de ANA.O maior crescimento da parte aérea foi induzido pelapresença de 2,68 µM de ANA, combinado com 1,11; 1,55 e 2,22µM de BAP (Figura 2C). Em  concentração elevada de ANA (5,37µM), foi observado o menor desenvolvimento da parte aérea dasplântulas em todas as combinações de BAP. Não foramverificadas diferenças significativas (P > 0,05) entre asconcentrações de ANA e BAP para o número de raízes porplântula; entretanto, estes tratamentos apresentaramdesempenho superior quando comparados à testemunha (Figura2D).CONCLUSÕESCom base nos resultados obtidos e nas condições emque o trabalho foi conduzido, pode-se concluir:1 - É possível a conversão in vitro de embriões zigóticos, isoladosde sementes maduras de açaizeiro, em plântulas completas enormais.2 - A  concentração de 2,68 µM de ANA, combinada com 1,11;1,55 ou 2,22 µM de BAP, promove o melhor crescimento da parteaérea das plântulas.3 - É necessária a presença de ANA e BAP no meio de culturapara a conversão de embriões zigóticos e para o crescimentoinicial de  plântulas cultivadas  in vitro.REFERÊNCIAS  BIBLIOGRÁFICASCOLLINS, G.B.; GROSSER, J.W. Culture of embryos. In: VASIL,I.K. (Ed.) Cell culture and somatic cell genetics of plants. NewYork: Academic Press, 1984. v.1,  p.241-257.HU, C.Y.; FERREIRA, A.G. 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Cultura in vitro de embriões zigóticos de açaizeiro.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/403863/4/8006.pdf

Cultura in vitro de embriões zigóticos de açaizeiro.

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