Suplemento. Edição dos Trabalhos do 49 Congresso Brasileiro de Olericultura, Águas de Lindóia, ago. 2009

BERTONI. V. W.

FRANÇA, S. de C.

PEREIRA, A. M. S.

SOUZA, A. V. de

TELLES, M. P. de C.

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Diversidade genética em populações naturais de infalível.

O objetivo deste trabalho foi estudar a variabilidade genética em diferentes populações de infalível por meio de marcador molecular RAPD visando fornecer subsídios para a conservação da espécie em bancos de germoplasma.Suplemento. Edição dos Trabalhos do 49 Congresso Brasileiro de Olericultura, Águas de Lindóia, ago. 2009

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Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009 1118SDiversidade genética em populações naturais de infalívelDIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES NATURAIS DEINFALÍVELAna Valéria de Souza1; Bianca Waléria Bertoni2, Suzelei de Castro França2; MarianaPires de Campos Telles3; Ana Maria Soares Pereira21Embrapa Semi-Árido – CPATSA, Km 458, Zona Rural, Cx.P. 601, CEP 56304-010, Perolina, PE; 2Deptº deBiotecnologia de Plantas Medicinais da Universidade de Ribeirão Preto (UNAERP); 3Laboratório de Genética &Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás (UCG), Goiânia, GO, Brasil; e-mail:ana.valeria@cpatsa.embrapa.br, bbertoni@unaerp.br, scfranca@unaerp.br, apereira@unaerp.br,tellesmpc@gmail.comRESUMOMandevilla velutina (Apocynaceae) éuma espécie endêmica do Cerrado, conhecidapopularmente como infalível ou batata-infalível,utilizada na medicina popular na forma de extratoalcoólico ou infusões do sistema subterrâneo,no tratamento de processos inflamatórios eacidentes com serpentes. Atualmente, estaespécie é apontada como uma das prioritáriasem programas de conservação, e por isso,estudos de diversidade genética e conservaçãoem bancos de germoplasma in vitro a fim deevitar sua extinção, são relevantes. O objetivodeste trabalho foi estudar a variabilidadegenética em diferentes populações de infalívelpor meio de marcador molecular RAPD visandofornecer subsídios para a conservação daespécie em bancos de germoplasma. A análisemolecular de variância (AMOVA) mostrou quea variabilidade dentro das populações (81,25%)foi maior que entre populações (18,75%). Essesresultados foram confirmados pelo Índice dediversidade de Nei. As estimativas de variaçãode PHIST (0,188) e qP (0,1586) indicam altaestruturação populacional. Não existe umarelação direta entre as distâncias genéticas egeográficas das três populações estudadas.PALAVRAS-CHAVE: Mandevilla velutina,extinção, planta medicinal, sistemasubterrâneo.ABSTRACTGenetic diversity among naturalpopulations of InfalívelMandevilla velutina (Apocynaceae) is anendemic species of the Cerrado, known asinfalível (guaranteed) or batata-infalível(guaranteed potato). M. velutina alcoholic extractand root infusions are extensively used in thepopular medicine for the treatment ofinflammatory diseases and against snake bites.Currently, this species has been pointed out ascrucial in conservation programs, thereforestudies on its genetic diversity and developmentof methodology for conservation in in vitrogermplasm banks are imperative in order to avoidits extinction. The objective of this work was toinvestigate the genetic variability of M. velutinaintra and inter populations using RAPD molecularmarkers to optimize the conservation of thespecies in germplasm banks. Analysis ofmolecular variance (AMOVA) indicated that thevariability intra population (81,25%) was superiorto inter population (18,75%). Those results wereconfirmed by the Nei’s diversity Index. The PHIstvalue of (0,188) and qP (0,1586) of the geneticvariation indicate high population structuring.There seems to be no direct correlation betweengeographic distances and genetic similarityamong the three studied populations.KEYWORDS: Mandevilla velutina, extinction,medicinal plant, root system.SOUZA AV; BIONDO R; BERTONI BW; FRANÇA SC; TELLES MPC; PEREIRA  AMS. 2009. Diversidade genética em populações naturais deinfalível. Horticultura Brasileira 27: S1118-S1123.1119Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009Diversidade genética em populações naturais de infalívelSINTRODUÇÃOO marcador molecular do tipo RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) é umatécnica que tem sido empregada para a análise da diversidade genética de espécies vegetaisnativas, estudos de mapeamento genético, genética de populações, sistemática molecular,“fingerprinting” de genótipos e seleção assistida por marcadores no melhoramento de plantas(Bittencourt, 2000; Gauer & Cavalli-Molina, 2000; Ciampi, 2001; Sales et al. 2001; Souza et al.2004). Mandevilla velutina é uma espécie endêmica do Cerrado, conhecida popularmentecomo infalível ou batata infalível, utilizada na medicina popular na forma de extrato alcoólico ouinfusões do sistema subterrâneo, no tratamento de processos inflamatórios e acidentes comserpentes (Almeida et al., 1998).Atualmente, esta espécie é apontada como prioritária em programas de conservação,devido o alto grau de endemismo e a maneira extrativista que vem sendo coletada pelapopulação. Como a técnica RAPD possibilita a seleção de genótipos de interesse, paraposterior conservação em bancos de germoplasma, o objetivo deste trabalho foi estudar avariabilidade genética em populações naturais de infalível, visando fornecer subsídios para aconservação da espécie.MATERIAL E MÉTODOSFolhas jovens de infalível foram coletadas nos municípios de São Carlos (SC), Pedregulho(PD) e Araxá (AR) e acondicionadas separadamente em tubos falcon devidamente identificadoscontendo sílica gel azul e posteriormente estocadas no freezer a - 20ºC até o momento daextração. A coleta foi aleatória e os dados de localização geográfica foram mapeados porSistema de Posicionamento Global (GPS). Para extração do DNA genômico, utilizou-se oprotocolo proposto por Doyle & Doyle (1987).O DNA extraído foi quantificado através da visualização da banda, sobre luz ultravioleta,em gel de agarose 1% (p/v) e corado com brometo de etídio. Esse DNA foi comparado comDNA padrão de concentrações conhecidas. Para a amplificação RAPD, as amostras de DNAforam avaliadas inicialmente com 100 iniciadores e somente as bandas reprodutíveis emdiferentes análises foram consideradas. A partir da ausência ou presença de bandas dosfragmentos amplificados, obteve-se uma matriz de dados binários, os quais foram utilizadospara estimar as freqüências alélicas, com base na correção proposta por Lynch & Milligan(1994). Em seguida foi realizada uma análise descritiva da variabilidade total calculando-se aporcentagem de locos polimórficos. As distâncias genéticas de Nei (1973, 1978) foram utilizadasem uma análise de agrupamento do tipo UPGMA (“unweighted pair-group method by arithmeticaverages”) (Legendre & Legendre 1998).A segunda forma de decompor a variância utilizada neste trabalho foi a AMOVA (Análiseda Variância Molecular), conforme proposto por Excoffier et al (1992). Para tanto utilizou-se osprogramas TFPGA (Miller 1997), AMOVA-PREP 1.01 (Miller 1998) e WINAMOVA 1.04(Excoffier, 1992), onde as freqüências alélicas foram submetidas a uma análise de variânciade freqüências alélicas (Weir 1996; Telles, 2000), que permite a decomposição da variânciagenética total em seus componentes entre e dentro de populações, possibilitando a avaliaçãoda estruturação da variabilidade.Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009 1120SDiversidade genética em populações naturais de infalívelRESULTADOS E DISCUSSÃOEntre os iniciadores avaliados, foram selecionados aqueles que permitiram a melhorintensidade de bandas e alto grau de polimorfismo.Os onze iniciadores escolhidos produziram 111 bandas, sendo a maioria polimórficanas três populações. O número mínimo de bandas por iniciador foi sete e o máximo quinze(Tabela 1). Os resultados da variabilidade genética, obtidos com as diferentes estimativasestatísticas indicaram que o marcador RAPD permitiu uma estimativa consistente na análisegenética das três populações naturais de infalível estudadas. Nos 67 indivíduos analisados aporcentagem total de locos polimórficos foi de 81,08%, sendo que a população de Araxáapresentou o maior valor (77,48%), seguida das populações de Sacramento (64,86%) ePedregulho (49,55%). (Tabela 2). A AMOVA baseada nos marcadores RAPD mostrou que amaior variabilidade genética está no componente intrapopulacional (81,25%), quandocomparado ao componente interpopulacional (18,75%), o que torna os resultados interessantes,porque a esta espécie apresenta cleistogamia.O valor de PHIST foi 0,188 (valor de p<0,001), indicando uma estruturação significativada variabilidade genética nestas populações (Tabela 3). A análise de variância de freqüênciasalélicas utilizada para avaliar a estruturação da variabilidade genética nas populações de M.velutina mostrou valores de qP que variaram de 0,027 a 0,2833, com um valor global de 0,1586(IC a 95% 0,2251 e 0,1037).O processo de dispersão das sementes é realizado pelo vento, uma vez que assuas sementes são leves e coroadas por denso tufo apical de pêlos finos, de 15 a 20 mmde comprimento (Almeida et al., 1998), que facilita o deslocamento das sementes a grandesdistâncias. De acordo com Loveless & Hamrick (1984), a dispersão de sementes pelovento aumenta a variação dentro das populações, mas isso depende da velocidade dovento e das características das sementes. Pequenas migrações de sementes a longasdistâncias podem evitar a divergência populacional. Esses dados corroboram com osresultados obtidos para a espécie em estudo, pois a maior parte da variabilidade genéticadas populações foi identificada dentro da população (81,25%). Para estimativas PHIST,significativamente diferentes de zero, valores superiores a 0,05 são consideradosindicadores de alta estruturação populacional, enquanto que valores abaixo de 0,05 indicambaixa estruturação (Solé-Cava, 2001). Como pode ser verificado na análise de variabilidadegenética entre e dentro das populações descritas anteriormente, as estimativas de variaçãoPHIST (0,188), foi superior ao valor limite de 0,05, indicando alta estruturação populacional,o que foi confirmado pela análise do padrão de variação espacial, que foi realizada utilizandoo coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as matrizes de distâncias genéticas deNei e as distâncias geográficas entre populações.O valor r encontrado para as matrizes foi de 0,80227, o que é um valor relativamentealto. As populações de Pedregulho e São Carlos apesar de serem mais próximasgeneticamente, são mais distantes no espaço geográfico. As populações de espéciesameaçadas de extinção se encontram freqüentemente estruturadas. Isso ocorre devido àdegradação ambiental, que pode favorecer a formação de refúgios (fragmentos), ondepequenas populações dessas espécies persistem, sem poder trocar genes com outrosacessos localizados em áreas não alteradas.1121Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009Diversidade genética em populações naturais de infalívelSPortanto, a análise do padrão de variação espacial para estudos de conservação émuito importante, porque se uma espécie ameaçada que ocupa uma determinada área,apresenta-se estruturada, a estratégia de conservação deve procurar preservar a diversidadeda espécie naquela área, pois já podem existir adaptações locais que se perderiam nocaso da população ser misturada com outras (Solé-Cava, 2001).AGRADECIMENTOSÀ FAPESP (Fundação de apoio a pesquisa do estado de São Paulo) e a Universidadede Ribeirão Preto (UNAERP).LITERATURA CITADAALMEIDA SP; PROENÇA CEB; SANO SM; RIBEIRO JF. 1998. Cerrado: Espécies vegetaisúteis. Planaltina: EMBRAPA-CPAC, 464 p.BITTENCOURT JVM. 2000. Variabilidade genética em populações naturais de Maytenusilicifolia por meio de marcadores RAPD. Universidade Federal do Paraná. 58p (Tese mestrado).CIAMPI AY. 2001. Uso de marcadores moleculares nos estudos de genética de populações deespécies florestais. In: III SIMPOSIO DE RECURSOS GENÉTICOS PARA AMÉRICA LATINAE CARIBE. Anais… Londrina, IAPAR. p. 19-22.DOYLE JJ; DOYLE JL. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus (Rockville), 12(1):13-15.EXCOFFIER L; SMOUSE PE; QUATTRO JM. 1992. Analysis of molecuar variant inferred frommetric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restrictiondada. Genetics 131:  479-491.EXCOFFIER L. WINAMOVA 1.04: ANALYSIS OF MOLECULAR VARIANCE (Programa paracomputados livre distribuído pelo autor). Disponível em: http://www.tien.utk.edu/~gross/WWW_pt2d.html. Acessado em fevereiro de 2005.GAUER L; CAVALLI-MOLINA S. 2000. Genetic variation in natural population of maté (Ilexparaguariensis A. St.-Hil., Aquifoliaceae) using RAPD markers. Heredity. 84: 647-656.LEGENDRE, P; LEGENDRE  L. 1998. Numerical Ecology. Elsevier. Amsterdam.LOVELESS MD; HAMRICH JL. 1984. Ecological determinants of genetic structure in plantpopulations. Annual Review and Systematics 15: 65-95.LYNCH M; MILLIGAN BG. 1994. Analysis of population genetic structure with RAPD markers.Molecular Ecology 3: 91-99.MILLER MP. TFPGA 1.03: 1997. Tools for populations genetics analyses (Programa paracomputador livre distribuído pelo autor) Disponível em <http://www.marksgeneticssoftwear.net/tfpga.htm>. Acessado em fevereiro de 2005.Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009 1122SDiversidade genética em populações naturais de infalívelMILLER MP. AMOVA-PREP 1.01: 1998. A program for preparation of AMOVA input from dominat-marker of raw data (Programa para computador livre distribuído pelo autor) Disponível em<http://www.marksgeneticssoftwear.net/amovaprep.htm>. Acessado em fevereiro de 2005.NEI M. 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 70(12): 3321-3323.NEI M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small numberof individuals. Genetics 89: 583-590.SALES E; et al. 2001. Population genetic study in the Balearic endemic plant species Digitalisminor (scrophulariaceae) using RAPD markers. American Journal of Botany 88(10): 1750-1759.SOLÉ-CAVA AM. 2001. Biodiversidade molecular e genética da conservação. In: MATIOLISR. (ed.) Biologia Molecular e conservação. Ribeirão Preto:Editora Holos,  p.172-192.SOUZA LMFI.; KAGEYAMA PY; SEBBENN AM. 2004. Estrutura genética em populaçõesfragmentadas de Chorisia speciosa St. Hil (Bombacaceae). Scientia Forestalis  65: 70-79.TELLES MPC. 2000. Diversidade genética e estrutura populacional de cagaitera (Eugeniadysenterica DC.) do sudeste de Goiás. Goiânia. Escola de Agronomia e Engenharia deAlimentos, Univeridade Federal de Goiás, 129p (Tese mestrado).WEIR BS. 1996. Genetic Data Analysis II. Sunderland, Massachussets: SinauerAssociates.445p.Tabela 1. Iniciadores utilizados e marcadores RAPD obtidos para 67 indivíduos de infalível. Primers used andRAPD markers obtained for 67 individuals from infalivel. Ribeirão Preto, UNAERP, 2007.Número de bandasIniciadores Seqüências (5’→ 3’)Total Polimórficas Monomórficas1 CAGGCCCTTC 9 5 42 TGCCGAGCTG 12 12 03 AGGTGACCGT 8 7 14 GTCCACACGG 9 8 15 CAGCACCCAC 10 10 06 TCGCCCAGTG 7 6 17 TGCCGAGCTG 8 7 18 GAATATGGGTGCGCTCTG 8 8 09 AGGGGTCTTG 13 10 310 AAGGGATTGTTCTGTTCGCTG 15 11 411 TGATTACACCAATTACCACG 12 8 4Total 111 92 191123Hortic. bras., v. 27, n. 2 (Suplemento - CD Rom), agosto 2009Diversidade genética em populações naturais de infalívelSTabela 2. Estatística descritiva básica das populações de infalível estudadas. Assumiu-se equilíbrio de Hardy-Weimberg. Tamanho médio da amostragem (n) e porcentagem de locos polimórficos (P). Resultados obtidospelo programa POPGENE (Yeh et al. 1999). Basic descriptive statistics of the populations studied infalivel. Haveassumed equilibrium of Hardy-Weimberg. Average sample size (n) and percentage of polymorphic loci (P).Results obtained by the program POPGENE (Yeh et al. 1999). Ribeirão Preto, UNAERP, 2007.População n PPD 10 49,55SC 16 64,86AR 41 77,48Total 67 81,08Tabela 3. AMOVA entre e dentro de populações para os 111 indivíduos de infalível G. L., grau de liberdade. S. Q.,soma dos quadrados. S. Q. M., soma dos quadrados médios. p, nível de significância da estimativa de variaçãogenética, utilizando 1000 permutações. Estatística PHIST, variação genética estimada para fonte de variação,análoga à estatística-FST de Wright. Resultados obtidos pelos programas AMOVA-PREP 1.01 (Miller 1998) eWINAMOVA 1.04 (Excoffier, 1992). AMOVA among and within populations for the 111 individuals from infallibleGL, degree of freedom. SQ, sum of squares. SQM, sum of mean squares. p, level of significance of the estimateof genetic variation, using 1000 permutations. Statistics PHIST, genetic variation estimated for source of variation,similar to the statistics of Wright-FST. Results obtained by the program AMOVA-PREP 1.01 (Miller 1998) andWINAMOVA 1.04 (Excoffier, 1992). Ribeirão Preto, UNAERP, 2007.Fonte deG. L. S. Q. S. Q. M.Componentes % do TotalpEstatísticavariação de variância de variação -PHISTEntre populações 2 142,22 71,11 3,37 18,75 <0,001 0,188Dentro de populações 61 890,84 14,60 14,60 81,25 - -Total 63 1033,06 - - - - -

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