Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR paraidentificar o mRNA do gene de ?-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinaçãodas cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianatode guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foiobtido cDNA com utilização de “random primers”

ARAGÃO, C. A.

ARAÚJO JÚNIOR, J. P.

CAVARIANI, C.

DANTAS, B. F.

NAKAGAWA, J.

RODRIGUES, J. D.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

IDENTIFICAÇÃO DO mRNA DE α-AMILASE EM SEMENTES DE MILHORevista Brasileira de Sementes, vol. 24, nº 2, p.113-117, 2002113PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA DO RT-PCR UTILIZADO PARAIDENTIFICAÇÃO DO mRNA DA α-AMILASE EM SEMENTES DE MILHO11 Aceito para publicação em 23/09/2002.2 Engo Agro MSc. Doutoranda, Pesquisadora, EMBRAPA/CPATSA, Cx.Postal  23, 56300-970, Petrolina-PE; e-mail: barbara@cpatsa.embrapa.br3 Engo Agro, Msc., Doutorando, Prof. Departamento de Tec. e CiênciasSociais, FAMESF, UNEB, Juazeiro-BA.BÁRBARA FRANÇA DANTAS2, CARLOS ALBERTO ARAGÃO3, JOÃO PESSOA ARAÚJO-JUNIOR4,JOÃO DOMINGOS RODRIGUES5, CLÁUDIO CAVARIANI6, JOÃO NAKAGAWA6RESUMO - Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pelaatividade de α-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definiçãoda cinética de síntese de a-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR paraidentificar o mRNA do gene de α-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinaçãodas cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do  tiocianatode guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foiobtido cDNA com utilização de “random primers”. A amplificação por PCR de uma porção dogene da α-amilase foi realizada com os  “primers”: “sense” - CGACATCGACCACCTCAAC;“antisense” - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNApolimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificaçãoforam 94oC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94oC durante 1 minuto, 42oC durante 1minuto e 72oC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72oC por 5 minutos. O produto do RT-PCRapresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas,não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficientepara a identificação da expressão de α-amilase durante a germinação das sementes e pode serusado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentosde germinação.Termos para indexação: Zea mays, sementes, α-amilase, RT-PCR.RT-PCR PATTERNING FOR α-AMYLASE MESSENGER RNA IDENTIFICATION INGERMINATING MAIZE SEEDSABSTRACT - During germination the seed reserve carbohydrates are degraded by α-amylaseactivity. The identification of mRNA is a very important tool for definition of α-amylase synthesiskinetics. This study aimed to adapt a PT-PCR methodology for α-identification of amylase mRNAin germinating maize seeds. After three days germination of Saracura BRS4154 and CATI AL34maize cultivars, the total RNA was isolated by the guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformextraction method, with some modifications. The cDNA was obtained from the total RNA, usingrandom primers. The α-amylase gene PCR amplification was carried out with cDNA, primers(sense - CGACATCGACCACCTCAAC; antisense - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC);gelatina; DMSO and 1,25 units of Taq DNA polimerase per reaction and complete with DEPCwater. The amplification cycles were 94oC/4 minutes, 34 cycles of 94oC /1 minute, 42oC/1 minute4 Médico Veterinário, Dr., Prof. Departamento de Microbiologia eImunologia IB, UNESP, Botucatu-SP.5 Engo Agro, Dr., Prof. Departamento de Botânica, IB, UNESP, Botucatu-SP.6 Engo Agro, Dr., Prof. Departamento de Produção Vegetal, FCA, UNESP,Botucatu-SP.Comunicação Técnica:B.F. DANTAS et al.Revista Brasileira de Sementes, vol. 24, nº 2, p.113-117, 2002114and 72oC/1,5 minutes, and finally 72oC/5 minutes. The RT-PCR product visualization in agarosegel eletcrophoresis indicated that this method presented well defined bands of 249 bp for the boththe cultivars, without  unspecific bands. The  RT-PCR is an eficient method for α-amylase expressionstudies during germination and can be used as a tool for quantitative and qualitative researchabout α-amylase sinthesis kinetics.Index terms: seeds, Zea mays, α-amylase, RT-PCR.INTRODUÇÃOO termo “qualidade das sementes” envolve aspectos ge-néticos, físicos, fisiológicos e sanitários (Carvalho &Nakagawa, 2000) que, avaliados de maneira integrada, pro-piciam o conhecimento do valor real e do potencial de utili-zação de um lote de sementes.A pesquisa na área de biologia molecular associada aocontrole de qualidade de sementes tem evoluído rapidamentee novas técnicas têm-se mostrado úteis na obtenção de clas-ses distintas de marcadores moleculares. Estes auxiliam naelucidação dos fatores que afetam a qualidade, a manipula-ção, a identificação e preservação do material genético, per-mitindo o monitoramento de todo o processo produtivo.Segundo Carvalho et al. (2000) várias pesquisas têm sidodesenvolvidas para detectar as diversas reações metabólicasque envolvem síntese e degradação de moléculas durante odesenvolvimento, a germinação e a deterioração de sementes.Esses mesmos autores afirmam que durante a fase dematuração das sementes, a análise do acúmulo de materiaisde reserva por meio de marcadores moleculares pode forne-cer indícios da qualidade das sementes e que a atividade daenzima α-amilase tem sido utilizada como marcador relacio-nado com a tolerância à secagem de sementes de milho.Durante a germinação das sementes, as reservas insolú-veis de alto peso molecular são degradadas e convertidas aformas solúveis, que são rapidamente transportadas aos teci-dos em crescimento e utilizadas em reações de síntese ou deprodução de energia. As modificações metabólicas que ocor-rem nesses estágios são resultados da atividade de váriasenzimas de hidrólise e transferência (Bewley & Black, 1985).A α-amilase tem um papel fundamental nesse processo porcatalizar clivagens endoglicolíticas ao acaso das ligaçõesα-1,4 entre os resíduos de glicose das cadeias de amilose eamilopectina que compõem as reservas de amido de semen-tes de cereais (Mayer & Poljakoff-Mayber, 1978). São váriosos fatores que influenciam na síntese e atividade de a-amilasedurante a germinação das sementes e grande número de estu-dos de caracterização e expressão de α-amilase tem sido con-duzidos em cevada, trigo e arroz (Fincher, 1989). No milho,no entanto, existem poucos trabalhos sobre os processos detranscrição, tradução e ativação dessa enzima durante a ger-minação.Muitas pesquisas têm sido realizadas utilizando a técni-ca da transcrição reversa acoplada com a reação de polimeraseem cadeia, comumente chamada de RT-PCR (“ReverseTranscriptase-Polimerase Chain Reaction”). Carlson &Chouery (1998) utilizaram a RT-PCR para estudar a funçãoda enzima invertase em sementes de mutantes mn1 de milho.Li (1998) utilizou essa técnica em combinação com análisede enzimas de restrição para diferenciar entre a expressão degenes ltk, responsáveis pela transdução de sinais durante odesenvolvimento do endosperma das sementes de milho.A utilização de técnicas de identificação de RNA men-sageiro (mRNA) durante o processo de germinação pode de-finir a cinética de produção de α-amilase, bem como a influ-ência de fatores abióticos (umidade, temperatura) na ativida-de dessa enzima e, consequentemente, na germinação dassementes. No entanto, poucos trabalhos são realizados com oobjetivo de se definir a expressão do gene de α-amilase emsementes de milho (Mundy et al., 1985;  Sanwo & Demason,1993; 1994; Sachs et al, 1996). O presente trabalho teve comoobjetivo padronizar a metodologia da técnica do RT-PCR uti-lizada na identificação do mRNA produzido a partir do genede α-amilase durante a germinação de sementes de milho.MATERIAL E MÉTODOSO trabalho foi conduzido no Laboratório de Sementesdo Departamento de Agricultura da Faculdade de CiênciasAgronômicas e no Laboratório de Virologia do Departamen-to de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociênciasda Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu-SP,nos meses de janeiro a maio de 2001.Sementes de milho das cultivares Saracura-BRS 4154 eCATI-AL34 foram distribuídas em caixas plásticas tipo“gerbox” sobre duas camadas de papel mata-borrão e coloca-das em germinador a 27oC, no escuro, durante 3 dias. Apósesse período foi realizada a extração do RNA total, segundométodo do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio propostoIDENTIFICAÇÃO DO mRNA DE α-AMILASE EM SEMENTES DE MILHORevista Brasileira de Sementes, vol. 24, nº 2, p.113-117, 2002115por Chomczynski & Sacchi (1987), com algumas modifica-ções. Os escutelos e embriões das sementes foram maceradosem 2 mL de solução desnaturante composta por 4 mol.L-1 detiocianato de guanidina; 25 mmol.L-1 do tampão citrato desódio, pH 7,0; 0,5% sarcosil e 0,1 mmol.L-1 2-mercaptoetanol,utilizando-se almofariz e pistilo até a formação de umasuspensão homogênea. Essa suspensão foi transferida paratubos de 1,5 mL, sendo então adicionados mais 500 µL desolução desnaturante; 50 µL do tampão acetato de sódio2 mol.L-1, pH 4,0 e 500 µL de fenol saturado em água.As amostras foram centrifugadas a 12000 xg durante 10minutos a 4oC, coletando-se o sobrenadante. Foram adicio-nados 200 µL de clorofórmio às amostras, homogeneizadas eincubadas no gelo, durante 15 minutos. Estas foram entãocentrifugadas a 12000 xg durante 15 minutos a 4oC. Osobrenadante foi transferido para tubos novos e o RNA foiprecipitado em 500 µL de isopropanol. As amostras forammantidas à temperatura ambiente durante  10 minutos ecentrifugadas a 12000xg por 10 minutos a 4oC. O sobrenadantefoi removido sendo mantido o precipitado contendo RNAtotal. O RNA total foi lavado em etanol 75% por centrifugaçãoa 7500 xg por 5 minutos a 4oC e dissolvido em 100 µL deágua tratada com DEPC (dietil pirocarbonato), contendo 10unidades de inibidor de RNAse (RNAguard®) e incubado a56oC durante 10 minutos.Para comparação com este método, foi realizada extra-ção do RNA total utilizando-se o reagente Trizol®, conformeinstruções do fabricante (GIBCO BRL®).A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA adicio-nando, em tubos de 500 µL, 1 µL de “random primer” (75 ng);2 µL do inibidor de RNAse (20 unidades); 1 µL de gelatina1%; 1-5 µg RNA total e completados para 12 µL com águatratada com DEPC, sendo incubados a 70oC durante 10 mi-nutos e resfriados a 4oC. Foi adicionado 5 µL de tampão 5XFirst Strand® (250 mmol.L-1 Tris-HCl pH 8.3, 375 mmol.L-1KCl, 15 mmol.L-1 MgCl2); 2 µL de 0,1 mol.L-1 DTT e 1 µL de10 mmol.L-1 de dNTP. Após incubação a 42oC durante 2 mi-nutos foram adicionadas 20 unidades de transcriptase reversa(SUPERSCRIPT® II, GIBCO BRL®, Life Technologies) e agita-do. O meio de reação foi, então, incubado a 25oC por 5 minutos;42oC por 50 minutos; 70oC por 15 minutos e resfriadas a 4oC.A amplificação por PCR do gene de α-amilase foi reali-zada em volume total de 25 µL contendo 3 µL do cDNAobtido anteriormente; 2,5 µL de tampão PCR buffer®(200mmol.L-1TRIS-HCl pH8.4, 500mmol.L-1 KCl); 100µmol.L-1 dNTP; 1,5 mmol.L-1 MgCl2; 0,6 µmol.L-1 de cada“primer” (“sense”- CGA CAT CGA CCA CCT CAA C;“antisense” - TTG ACC AGC TCC TGC CTG TC); 4%DMSO; 1,25 unidades de Taq DNA polimerase (GIBCOBRL®) por reação e completados com água tratada com DEPC.Além desses reagentes, foram adicionados 0,01% gela-tina e 4% DMSO ao meio de reação para avaliar o efeitodessas substâncias na eficiência da amplificação.Foi colocada nos tubos, em seguida, uma gota de óleomineral. Os ciclos para a amplificação foram 94oC durante 4minutos, seguidos por 34 ciclos de 94oC durante 1 minuto,42oC durante 1 minuto e 72oC durante 1,5 minutos e final-mente 72oC por 5 minutos. As amostras foram então resfria-das a 4oC.Os “primers” foram selecionados a partir da seqüênciado gene a-amilase (Acesso L25805, Young et al., 1994) utili-zando o software Gene Runnerâ (Figura 1).A identificação do fragmento amplificado foi realizadapor eletroforese em gel de agarose 1,5% e coloração combrometo de etídio.RESULTADOS E DISCUSSÃOA extração do RNA total pelo método proposto porChomczynski & Sacchi (1987), com as soluções utilizadaspreparadas no próprio laboratório, foi mais eficiente que ouso do kit de extração Trizol®. Devido à alta concentração deCG (67%) do produto de RT-PCR (Figura 1a) as fitas decDNA não se separam facilmente, não havendo amplifica-ção, conforme observado em  testes anteriores (dados nãopublicados). A adição de DMSO 4% ao meio de reação pro-piciou melhor separação das fitas de cDNA, permitindo oanelamento dos “primers” e uma amplificação satisfatória. Aobtenção de cDNA com transcriptase reversa foi mais efici-ente com a utilização do “random primer” do que quando foiutilizado oligoDT, devido ao tamanho do gene de α-amilase,1627 pb (Figura 1, Young et al., 1994). O “primer” oligoDTinicia a transcrição reversa na cauda poli-A do mRNA (16053´-16215´), e a enzima transcriptase reversa não consegue trans-crever todo o gene. Os “primers” selecionados para o PCRpropiciaram o aparecimento de apenas uma banda de 249 pb,sendo específicos para o gene de α-amilase, uma vez que ocDNA foi obtido a partir do RNA total (Figuras 1 e 2). Oproduto do RT-PCR observado nas duas cultivares foi umabanda de 249 pb bem definida e sem a presença de bandasinespecíficas (Figura 2).Pode-se concluir, portanto, que o RT-PCR é uma eficien-te metodologia para a identificação da expressão de α-amilasedurante a germinação das sementes.B.F. DANTAS et al.Revista Brasileira de Sementes, vol. 24, nº 2, p.113-117, 20021161 ttgctgtcgc acggagaaga aaaaaaaaac aggcactgag ctgagatggc gaagcacttg61 gctgccatgt gcaggtgcag cctcctagtg cttgtactgc tctgcttggg ctcccagctg121 gcccaatccc aggtcctctt ccagggtttc aactgggagt cgtggaagaa gcaaggtggg181 tggtacaact acctcctggg gcgggtggac gacatcgccg cgacgggggccacgcacgtc241 tggctcccgc cgccgtcgca ctcggtggcg ccgcaggggt acatgcccgg ccggctctac301 gacctggacg cgtccaagta cggcacccac gcggagctca agtcgctcac cgcggcgttc361 cacgccaagg gcgtcaagtg cgtcgccgac gtcgtgatca accaccgctg cgccgactac421 aaggacggcc gcggcatcta ctgcgtcttc gagggcggca cgcccgacagccgcctcgac481 tggggccccg acatgatctg cagcgacgac acgcagtactccaacgggcgcgggcaccgc541 gacacggggg ccgacttcgc cgccgcgccc gacatcgacc acctcaacccgcgcgtgcag601 caggagctct cggactggct caactggctc aagtccgacc tcggcttcga cggctggcgc661 ctcgacttcg ccaagggcta ctccgccgcc gtcgccaagg tgtacgtcga cagcaccgcc721 cccaccttcg tcgtcgccga gatatggagc tccctccact acgacggcaa cggcgagccg781 tccagcaacc aggacgccga caggcaggagctggtcaactgggcgcaggcggtgggcggc841 cccgccgcgg cgttcgactt caccaccaagggcgtgctgcaggcggccgt ccagggcgag901 ctgtggcgca tgaaggacgg caacggcaaggcgcccgggatgatcggctg gctgccggag961 aaggccgtca cgttcgtcga caaccacgac accggctcca cgcagaactc gtggccattc1021 ccctccgaca aggtcatgca gggctacgcc tatatcctca cgcacccaggaactccatgc1081 atcttctacg accacgtttt cgactggaac ctgaagcagg agatcagcgcgctgtctgcg1141 gtgaggtcaagaaacgggatccacccggggagcgagctga acatcctcgccgccgacggg1201 gatctctacgtcgccaagattgacgacaag gtcatcgtga agatcgggtc acggtacgac1261 gtcgggaacc tgatcccctc agacttccac gccgttgccc atggcaacaa ctactgcgtt1321 tgggagaag acggtctgag agttccagcg gggcggcaccactagactagacccattccg1381 cccagcaacc cctacagata attctctttt caggtccatt ttgaacctgg aaaagaaatt1441 taagagaggc taaataaccg gaatacgatt gtgtactgag cttctttcacgtaattattg1501 aaagaagatt ataatgtttg gatgcactat taattatgtt ggcatgggga tttttgtaac1561 ctcttaaaac gaggaaataa agactgttc ttattaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa1621 atctaga           Primer sense1        570 5’             3’588           1627   799 3’         5’818Primer antisense          249bpABFIG. 1. Seqüência  do gene de α-amilase e localização do produto de RT-PCR no gene.A - Seqüência do gene proposta por Young et al (1994). “Primers” em negrito; B - Esquema representativo da localização doproduto de RT-PCR no gene de α-amilase.FIG. 2. Eletroforese em gel de agarose 1,5% do produto deRT-PCR demostrando o produto do gene de α-amilase de sementes de milho das cultivares Saracura(a) e AL34 (b). A seta indica a banda de 249 pbproduzida com os “primers” desenhados.249bpIDENTIFICAÇÃO DO mRNA DE α-AMILASE EM SEMENTES DE MILHORevista Brasileira de Sementes, vol. 24, nº 2, p.113-117, 2002117REFERÊNCIASBEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development andgermination. NewYork: Plenum Press, 1985. 367p.CARLSON, S.J.; CHOUREY, P.S. Molecular analysis of maizeminiature1 seed mutants–a progress report. In: MAIZEGENETICS CONFERENCE. Abstracts...  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Do members of the ltk gene family transduce signals forendosperm development? In: MAIZE GENETICS CONFERENCE.Abstracts... Disponível em: < www.agron.missouri.edu/cgi-bin/sybgw_mdb/ mdb3/Reference/222863 1998.>  Acesso em: diamês(abreviado) 2002MAYER, A.M.; POLJAKOFF-MAYBER, A. The germination ofplants. 4ed. Oxford: Pergamon Press 1978. 270p.MUNDY, J.; BRANDT, A.; FINCHER, G.B. Messenger RNAs fromthe scutellum and aleurone of germinating barley encode (1-3, 1-4)-β-D-glucanase, α-amylase anda carboxipeptidase. Plant Physiology,Rockville, v.79, n.4, p.867-871, 1985.SACHS, M.M.; SUBAIAH, C.C.; SAAB, I.N. Anaerobic geneexpression and flooding tolerance in maize Journal of ExperimentalBotany, v.47, n.294, p.1-15, 1996.SANWO, M.M.; DEMASON, D.A. Characteristics of a-amylaseduring germination of two high-sugar sweet corn cultivars of Zeamays L. Plant Physiology, v.99, n.7, p.1184-92, 1993.SANWO, M.M.; DEMASON, D.A. Gibberellic acid (GA3)-inducedenhancement of α-amylase activity in the aleurone of shrunken-2maize kernels. American Journal of Botany, v.81, n.8, p.987-96,1994.YOUNG, T.E.; DEMASON, D.A.; CLOSE, T.J. Cloning of an a-amylase cDNA from aleurone tissue of germinating maize seed.Plant Physiology, Rockville, v.105, n.2, p.759-760, 1994.

Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da α-amilase em sementes de milho.

Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR paraidentificar o mRNA do gene de ?-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinaçãodas cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianatode guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foiobtido cDNA com utilização de “random primers”.Made available in DSpace on 2011-04-09T20:42:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da a-amilase em sementes de milho.

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