ALENCAR, M. M. de

NÉO, T. A.

OLIVEIRA, H. N. de

OLIVEIRA, M. C. de S.

REGITANO, L. C. de A.

SILVA, A. M. da

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file:///E:/6_Melhoramento/874.htm1 de 4 10/08/2005 09:33 Voltar DETECÇÃO MOLECULAR DE "BABESIA BIGEMINA" EM BOVINOS DE DIFERENTESGRUPOS GENÉTICOS1  MÁRCIA CRISTINA DE SENA OLIVEIRA2, LUCIANA CORREIA DE ALMEIDAREGITANO3, MAURÍCIO MELLO DE ALENCAR3, ANA MARY DA SILVA3, HENRIQUENUNES DE OLIVEIRA4, THALITA ATHIÊ NÉO5  1 Projeto financiado pelo CNPq2  Pesquisador da Embrapa Pecuária Sudeste, Rodovia Washingon Luiz km 234, São Carlos, SP.marcia@cppse.embrapa.br.3 Pesquisador da Embrapa Pecuária Sudeste.4 FMVZ/UNESP-Botucatu5 Aluna de graduação UNIARA  RESUMO A taxa de infecção por "Babesia bigemina" foi estudada em bovinos de diferentes gruposgenéticos, criados em área endêmica do estado de São Paulo. Amostras de sangue obtidas de 213animais (52 Nelore, 55 Canchim/Nelore, 54 Angus/Nelore e 52 Simental/Nelore) foram utilizadas paraconfecção de esfregaços, determinação do hematócrito e para extração de DNA. Os esfregaços de sangueforam fixados, corados com Giemsa e examinados em microscópio óptico. Todas as amostras de DNAforam submetidas a amplificação pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e"Nested"-PCR usando "primes" específicos para  "Babesia bigemina". Pelo exame microscópico foramdetectadas parasitemias somente nos animais mais jovens (até 15 meses), sendo quatro em Nelore(11,8%), um em Canchim/Nelore (3,0%), dois em Angus/Nelore (11,8) e dois em Simental/Nelore (6,5%),não sendo significativa a  diferença entre os animais Nelore e cruzados. Não foram observados sinaisclínicos de babesioses assim como qualquer associação entre a presença de hemoparasitas e os valoresde hematócrito. Utilizando-se a técnica de amplificação do DNA parasitário, foram verificadas taxas deinfecção de 96,1% para o grupo Nelore, 98,2% para o Canchim/Nelore, 87% para o Angus/Nelore e 90%para o Simental/Nelore, não havendo diferenças significativas em função da idade ou raça dos animais.  PALAVRAS-CHAVE Suscetibilidade genética, babesioses, bovinos, PCR, "Nested" PCR        MOLECULAR DETECCION OF "BABESIA BIGEMINA" INFECTION IN CATTLE OF DIFFERENTGENETIC GROUPS  ABSTRACT The infection rate for "Babesia bigemina"  was estimated in cattle of different genetic groupsreared  in a endemic area of São Paulo State. Blood samples obtained from 213 animals were used forperform thick blood films, determination of packed cell volume (PCV) and for DNA extraction. Thick bloodfilms were fixed, stained by Giemsa and examined in an optical microscope. All of the DNA samples weresubmitted to amplification by Polimerase Chain Reaction (PCR) and Nested-PCR methods using specificprimers for and "B. bigemina". Babesia merozoites were only detected in young animals. Clinical signs ofbabesiosis were not observed as well any association between the presence of hemoparasites and PCVvalues. Analysis of PCR and N-PCR blood products reveled infections rates of 96,1% for Nelore group,file:///E:/6_Melhoramento/874.htm2 de 4 10/08/2005 09:3398,2% for Canchim/Nelore, 87% for Angus/Nelore and 90% for Simental/Nelore. The infection rates did notdiffered significantly among genetic groups or age of the animals.   KEYWORDS Breed susceptibility, babesiosis, cattle, PCR, "nested" PCR        INTRODUÇÃOA babesiose bovina é considerada a doença de maior impacto econômico entre as queacometem bovinos criados em regiões tropicais e subtropicais do mundo (Guglielmone,1997). A utilização de animais de raças zebuínas tem sido uma alternativa paraminimizar os prejuízos provocados por esses parasitas. Animais puros "Bos indicus" sãomuito resistentes a "B. bigemina" e relativamente resistentes a "B. bovis". No entantoanimais cruzados "Bos taurus"/ "Bos indicus" podem sofrer risco severo de mortalidadequando expostos a cepas virulentas (Bock et al., 1997). Os métodos de diagnósticosnormalmente utilizados não são adequados para determinar a prevalencia de portadoresentre os animais assintomáticos, razão pela qual não existem no Brasil dados relativos àprevalência desse protozoário entre os animais dos diversos grupos genéticosexplorados para produção de carne. Técnicas de amplificação de DNA têm se mostradoaltamente sensíveis para esse fim, detectando parasitemias da ordem de 0,00000017%(Oliveira-Sequeira et al., 2005). Dessa maneira o presente trabalho foi delineado, com opropósito de investigar as diferenças nas taxas de infecção por  "Babesia bigemina" embovinos da raça Nelore e seus cruzamentos com raças taurinas, em faixas etárias ondenormalmente não ocorrem manifestações clínicas da doença, utilizando a Reação emCadeia da Polimerase (PCR).  MATERIAL E MÉTODOSForam colhidas amostras de sangue de 212 fêmeas, sendo 52 da raça Nelore, 55cruzadas Canchim/Nelore, 52 Simental/Nelore e 53 Angus/Nelore com idades variandoentre 8 e 72 meses. Esfregaços de sangue periférico corados com Giemsa, foramexaminados em microscópio para pesquisa de hemoparasitas. O volume globular foideterminado por meio da técnica de microhematócrito. A extração de DNA das amostrasde sangue foi feita empregando-se o kit para extração GFX (Amersham Biosciences) eas reações de PCR e N-PCR foram realizadas empregando-se "primers" específicospara "Babesia bigemina" (Figueroa et al.1993). Os produtos de amplificação foramsubmetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, contendo brometo de etídio evisualizados em transiluminador UV. Foram consideradas positivas as amostras cujosfragmentos amplificados apresentaram tamanho aproximado de 278 pb. As amostrasnegativas foram submetidas a uma segunda reação ("Nested"-PCR) bem mais sensível eforam consideradas positivas as amostras que apresentaram à eletroforese fragmentoscom 170 pb. A análise estatística foi realizada utilizando-se o Sistema de AnalisesEstatísticas SAS (1996), sendo utilizados o teste exato de Fischer para determinar asassociações entre taxas de infecção e raça e o procedimento GLM para determinar oefeito da infecção sobre o hematócrito. Para fins de análise os animais foram separadospor faixa etária em três grupos: até 15 meses; entre 16 e 40 meses; e mais que 40meses.   RESULTADOS E DISCUSSÃOfile:///E:/6_Melhoramento/874.htm3 de 4 10/08/2005 09:33Pelo exame microscópico foram detectadas parasitemias somente nos animais maisjovens (até 15 meses), sendo quatro em Nelore (11,8%), um em Canchim/Nelore (3,0%),dois em Angus/Nelore (11,8) e dois em Simental/Nelore (6,5%), não sendo significativaa  diferença entre os animais Nelore e cruzados. Não foram observados sinais clínicosde babesioses assim como qualquer associação entre a presença de hemoparasitasneste exame e os valores de hematócrito.  Talvez devido ao pequeno número deanimais positivos no exame microscópico.A Tabela 1 apresenta os resultados da taxa de infecção por “Babesia bigemina” deacordo com os resultados do exame molecular para os animais da primeira e segundaclasses de idade. Os animais acima de 40 meses foram eliminados das análises devidoà irregularidade da distribuição por raça. Verifica-se na tabela que pelo exame de menorsensibilidade  (PCR)  as taxas de infecção ficam próximas de 55% para o Nelore, 41%para o Canchim/Nelore e 27% para os outros dois cruzamentos. A análise estatísticamostrou  associação significativa entre grupo genético e taxa de infecção (p<0,05). Asegunda reação (N-PCR), detecta níveis de parasitemia mais baixos e foi aplicadaapenas aos animais negativos na primeira análise. Acumulando com os resultados daprimeira reação, os resultados mostram uma proporção semelhante (p>0,05) de animaisinfectados em todos os grupos genéticos (96,1% para o grupo Nelore, 98,2% para oCanchim/Nelore, 87% para o Angus/Nelore e 90% para o Simental/Nelore). Sendo aprobabilidade de detecção no PCR proporcional a presença do parasita no sangue, esteresultado parece indicar que a parasitemia é maior quando mais genes zebuínos estãopresentes no animal. Dessa maneira, parece que a maior resistência às babésiasverificada por Bock et al.(1997) nesse grupo genético, não é conseqüência  de menorparasitemia.Os animais positivos na primeira reação (PCR) apresentavam valores de hematócritosignificativamente menores que os animais negativos (37,28% vs 39,13%). Não houveefeitos de idade e grupo genético para este parâmetro, e tampouco houve efeitosignificativo da interação entre grupo genético e diagnóstico, indicando que a influênciafoi semelhante em todos os grupos genéticos. Quando foram comparados animaispositivos e negativos na segunda reação (resultado acumulado), não foram verificadasdiferenças significativas. Mas neste caso, o número de animais negativos era muitopequeno.  Estes resultados parecem sugerir que embora nas faixas etárias estudadas os animaisnão apresentem sintomas clínicos com freqüência, a prevalência do parasita é muitoalta, e mesmo não sem casos clínicos os animais zebuínos e seus cruzamentos podemter seu desenvolvimento prejudicado devido a esta parasitose. Estudos posterioresutilizando métodos que permitam quantificar de maneira mais precisa a parasitemia porbabesias poderão elucidar os efeitos deste parasita sobre o desenvolvimento dosanimais.   CONCLUSÕESNão existem diferenças na prevalência da infecção por “Babesia bigemina” entre osdiversos grupos genéticos estudados. Apesar de serem mais resistentes às babesiosesos zebuínos são infectados, permanecem portadores e sofrem efeitos da parasitemiaquando criados em um área  endêmica.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1.   GUGLIELMONE, A.A.. Epidemiology of babesiosis and anaplasmosis in South andCentral America. Veterinary Parasitology. v.57, p.109-119, 1997.file:///E:/6_Melhoramento/874.htm4 de 4 10/08/2005 09:332.    BOCK, R.; DEVOS, A.J .; KINGSTON, T.G. et al. Effect of breed of cattle on innateresistance to infection with Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasmamarginale. Australian Veterinary J ournal. v.75, n.5, 1997.3.   OLIVEIRA-SEQUEIRA, T.C.; OLIVEIRA, M. C. S.; ARAUJ O J R. et al.  Erro!Indicador não definido.4.   FIGUEROA, J .V.; CHIEVES, L.P.; J OHNSON. G.S. et al.  Erro! Indicador nãodefinido.5.   SAS, Institute Inc. SAS/STAT.  User's Guide, version 6.11, 4 ed., v.2, Cary: SASInstitute INC., 1996. 842p.   Tabela 1 – Taxas de infecção por “Babesia bigemina” determinadas pelo exame molecular de acordocom o grupo genético para animais entre oito e 40 meses de idade.  Grupo Genético  Diagnóstico Nelore Can/Nel Angus/NelSim/Nel TotalN       2 (4,1%) 0 (0,0%) 1 (2,5,0%) 5 (12,8%) 8   (  3,0%)PCR     27 (55,1%) 16 (41,0%) 10 (25,0%) 12 (30,8%) 65 (38,2%)NPCR 20 (40,8%) 23(59,0%) 29 (72,5%) 22 (56,4%) 94 (56,3%)Total 49 39 40 39 167  

Detecção molecular de Babesia bigemina em bovinos de diferentes grupos genéticos.

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