MELO, N. F. de

Número cromossômico básico; Bandeamento cromossômico; Hibridização in situ

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XXVII Reunião Nordestina de Botânica................................Petrolina, 22 a 25 de março de 2004 Citogenética vegetal aplicada à taxonomia e ao melhoramento.  Natoniel Franklin de Melo Pesquisador da Embrapa Semi-Árido, C.P.23, Petrolina-PE, 56302-970 (natoniel@cpatsa.embrapa.br)   A utilização de dados citogenéticos na sistemática vegetal é considerada fundamental na compreensão das relações filogenéticas, tanto dentro de pequenos táxons, como espécies e gêneros, quanto em níveis mais superiores, como famílias e divisões (Stebbins, 1971; Guerra, 2000a). A análise de cariótipos, envolvendo a avaliação de dados como número e tamanho dos cromossomos, relação entre braços cromossômicos e presença de constrição secundária ou satélites, pode trazer informações valiosas para comparar espécies ou examinar a variação entre indivíduos da mesma espécie (Guerra et al., 1997; Venora & Padulosi, 1997).   As técnicas citogenéticas introduzidas nas últimas décadas têm fornecido novos dados na citotaxonomia e na caracterização de muitas espécies de interesse econômico. Dentre estas, pode-se destacar o bandeamento C, a coloração com fluorocromos, a localização de regiões organizadoras do nucléolo através da impregnação pela prata, a hibridização in situ, entre outras (Appels et al., 1998).  Número cromossômico básico A variação no número cromossômico pode surgir por diferentes meios, mas do ponto de vista evolucionário os mais importantes são a poliploidia e a disploidia (Stebbins, 1971; Grant, 1982a, b). Os poliplóides têm três ou mais conjuntos de cromossomos por núcleo, ao invés de dois como encontrado nos diplóides, sendo a poliploidia não somente um acontecimento comum, mas também recorrente em algumas espécies (Leitch & Bennett, 1997). Entre as angiospermas, a variação do nível de ploidia pode ser muito alta, variando de 2n=4, como observado, por exemplo, em Rhynchospora tenuis (Vanzela et al., 1996), a 2n= ca.640 em Sedum suaveolens (Uhl, 1978). Embora Stebbins (1971) tenha considerado cinco tipos de poliplóides, atualmente pode-se dividi-los em dois tipos principais: os neopoliplóides e os paleopoliplóides (Ehrendorfer, 1980; Guerra 2000a).  Neopoliplóides são poliplóides de origem mais recente, onde os diplóides relacionados ainda são representados nos dias atuais. Todos  1 XXVII Reunião Nordestina de Botânica................................Petrolina, 22 a 25 de março de 2004 os poliplóides intraespecíficos e muitos infragenéricos são exemplos de neopoliplóides, como relatado, por exemplo, em algumas espécies de Hordeum (Linde-Laursen et al., 1995), no primeiro caso, e na família Iridaceae, no segundo (Goldblatt & Takei, 1997). Paleopoliplóides, por outro lado, são poliplóides antigos sem diplóides próximos relacionados, encontrados em gêneros monotípicos, como Voanioala, nesse caso, com 2n=596 cromossomos em V. gerardii (Johnson et al., 1989), ou em táxons com alto número cromossômico e características primitivas. Vale salientar que embora os poliplóides sejam sempre derivados de diplóides, em muitos táxons algumas espécies ou gêneros poliplóides (paleopoliplóides) são mais primitivos que os diplóides relacionados (Guerra, 2000a, b). A disploidia corresponde a mudanças no número cromossômico devido a rearranjos cromossômicos estruturais, tais como a fusão Robertsoniana e a fissão cêntrica (Guerra, 1988). Fusão (disploidia descendente) é mais comum que fissão (disploidia ascendente), mas os dois tipos têm sido encontrados em vários gêneros. Goldblatt & Takei (1993), por exemplo, mostraram uma série displóide descendente com n=10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 e 3 no gênero Lapeirousia, além da combinação de poliploidia e disploidia descendente secundária nas espécies da seção Paniculata. Na família Arecaceae, Röser (1994) também encontrou freqüente redução do número de cromossomos em diversas subfamílias, como a Coryphoideae (2n=36 a 2n=28), Calamoideae (2n=36 a 2n=26), Ceroxyloideae (2n=34 a 2n=26) e Arecoideae (2n=36 a 2n=28). O conceito de número básico é definido como um dos números haplóides, observados em um táxon, que explica o mais parcimoniosamente possível a variabilidade cromossômica deste grupo e que demonstra um claro relacionamento com os números básicos de grupos próximos relacionados (Guerra, 2000a). Em alguns casos, a identificação do número básico é relativamente direta, devido a presença de apenas um número haplóide no grupo, como por exemplo, n=17 em Barbacenioideae (Melo et al., 1997), ou pela existência de apenas uma série poliplóide, como observado em Triticeae com n= 7, 14, 28, 35 e 42 (Sakamoto, 1991).  Em outros casos, entretanto, dois ou mais números displóides diferentes são encontrados, e a identificação do número básico é interpretada por outros critérios. Guerra (2000a) enumerou os seguintes critérios: o número haplóide mais baixo, aplicado em séries poliplóides, o número haplóide mais alto, aplicado em séries displóides descendentes, dois ou mais números haplóides, aplicados quando se encontra uma extensa variação numérica no grupo, o número haplóide mais freqüente, indicando  2 XXVII Reunião Nordestina de Botânica................................Petrolina, 22 a 25 de março de 2004 o número básico ou o número ancestral com variação mais bem-sucedida, e um número monoplóide hipotético, utilizado em táxon de origem paleopoliplóide.  Bandeamento cromossômico  As técnicas de bandeamento cromossômico são bastante valiosas na diferenciação de cromossomos ou cariótipos aparentemente similares com coloração convencional.  Kenton (1978), por exemplo, demonstrou através de bandeamento-C, um alto polimorfismo da heterocromatina dentro e entre populações diplóides (2n=10) e tetraplóides (2n=20) de Gibasis karwinskyana e G. consobrina.  No gênero Alstroemeria, o bandeamento-C foi usado para caracterizar o cariótipo de oito espécies brasileiras e chilenas, todas com número cromossômico diplóide 2n=16. Um número variável de grandes blocos intercalares e teloméricos de bandas-C foi observado nas espécies chilenas, enquanto as espécies brasileiras mostraram apenas pequenos blocos de bandas-C, sugerindo que o genoma dos dois grupos evoluíram diferentemente (Buitendijk & Ramanna, 1996). Na família Rutaceae, os gêneros Ruta e Dictammus estão classificados na mesma tribo, mas apresentaram características citológicas tão distintas, dentre as quais o padrão de bandas-C, que foi sugerido pertencerem a tribos diferentes (Guerra, 1985). Em alguns casos, a técnica de bandeamento-C também permite a identificação de vários tipos de heterocromatina, bem como de vários cromossomos, como relatado, por exemplo, em milho (Aguiar-Perecin, 1985a, b), sendo importante avaliar separadamente a distribuição de cada tipo de heterocromatina entre os diferentes cariótipos (Guerra, 2000c). Por outro lado, a heterocromatina também pode ser caracterizada por apresentar seqüências repetitivas com maior freqüência de pares de bases GC (guanina/citosina) ou AT (adenina/timina). O número e a posição dessas seqüências podem variar entre espécies, sendo detectadas com corantes fluorescentes que permitem a visualização de bandas no cariótipo. Os fluorocromos mais utilizados em vegetais são a cromomicina A3 (CMA), que cora preferencialmente regiões repetitivas ricas em GC, e o DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol), que cora preferencialmente regiões ricas em AT, embora a quinacrina e o Hoechst 33258, que coram preferencialmente heterocromatina rica em AT, além da mitramicina, que cora preferencialmente regiões ricas em GC, sejam também utilizados (Friebe et al., 1996).  Na família Arecaceae, Röser (1994, 1995) ressaltou a possibilidade de diferenciar algumas subfamílias através do padrão de condensação profásico e pelo  3 XXVII Reunião Nordestina de Botânica................................Petrolina, 22 a 25 de março de 2004 padrão de coloração com fluorocromos. Forni-Martins & Guerra (1999) estudaram seis espécies de Sesbania com 2n=12, relatando padrões variados de diferenciação cromossômica longitudinal através do bandeamento-C e coloração com os fluorocromos CMA e DAPI. Na subfamília Aurantioideae de Rutaceae, o padrão de bandeamento heterocromático foi estudado por Guerra et al. (2000) através da análise com CMA e DAPI. Murraya paniculata e M. koenigii apresentaram padrões de bandas CMA tão diferentes que foi sugerido a separação da última espécie no gênero Bergera, dentro da subtribo Clauseninae, enquanto M. paniculata seria classificada junto com o gênero Merrillia, dentro da subtribo Merrilliinae.  Hibridização in situ Uma das técnicas mais recentes na citogenética é a hibridização in situ. Esta técnica foi desenvolvida há mais de 30 anos por Gall & Pardue (1969) para localizar seqüências de ácidos nucléicos diretamente nos cromossomos. Nos últimos anos, a hibridização in situ vem sendo empregada com sucesso para localizar regiões específicas das mais variadas espécies silvestres e cultivadas. Em Vicia faba, por exemplo, foram localizadas as seqüências de DNAr 5S, 45S, elementos FokI, DNA telomérico, genes para proteínas da semente, entre outros (Fuchs et al., 1998a). No gênero Saccharum (cana-de-açúcar), D’Hont et al. (1998) estudaram o número e a localização do DNAr 5S e 45S em três das seis espécies que constituem o gênero, relatando uma correspondência entre nível de ploidia e número de sítios de DNAr. O mesmo foi relatado para o gênero Aloe (Adams et al., 2000). No gênero Passiflora, Melo & Guerra (2003) verificaram o silenciamento de alguns sítios gênicos redundantes de DNAr 5S, em espécies consideradas de origem paleopoliplóide. Em cevada (Hordeum vulgare), foi feito um mapeamento físico através de hibridização in situ com seqüências de DNAr 5S e um sítio do gene da α-amilase-2 (Leitch & Heslop-Harrison, 1993). Foi possível diferenciar cada braço cromossômico do cariótipo da cevada, além da localização do gene da α-amilase-2, observando-se uma discrepância significativa entre o mapeamento genético e o mapeamento físico da localização relativa à distância do centrômero. Da mesma forma, Fuchs et al. (1998b) utilizaram a hibridização in situ com oligonucleotídeos, genes de RNAr e proteínas da semente na identificação de cada par cromossômico de ervilha (Pisum sativum). Por outro lado, análises comparativas entre cultivares de uma dada espécie utilizando-se a hibridização in situ, têm sido pouco exploradas. Alguns estudos do  4 XXVII Reunião Nordestina de Botânica................................Petrolina, 22 a 25 de março de 2004 polimorfismo intraespecíficos no número de sítios de DNAr, por exemplo, foram relatados em Phaseolus vulgaris (Moscone et al. 1999). Neste caso, os loci do gene para RNAr em P. vulgaris mostraram variação intraespecífica no número e no tamanho do sinal. Diferentes mecanismos têm sido propostos para explicar a variação no número, tamanho e posição dos sítios de DNAr. Dentre esses, pode-se citar rearranjos cromossômicos (translocação, deleção, inversão e duplicação), trocas cromatídicas desiguais e eventos de transposição (Schubert & Wobus, 1985; Leitch & Heslop-Harrison, 1993; Zurita et al., 1997). Pedrosa et al. (2000) analisaram dez cultivares de Citrus sinensis através do padrão de bandas CMA/DAPI e por hibridização in situ com DNAr 5S e 45S, e verificaram um padrão invariável de bandas e sítios de DNAr entre as cultivares. Melo & Guerra (2001) também relataram estabilidade cariotípica entre quatro cultivares de aspargo (Asparagus officinalis), apesar da existência de um heteromorfismo de tamanho dos sítios de DNAr 45S em uma das cultivares.   Referências Bibliográficas Adams SP, Leitch IJ, Bennett MD, Chase MW, Leitch AR. 2000. Ribosomal DNA evolution and phylogeny in Aloe (Asphodelaceae). 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Citogenética vegetal aplicada à taxonomia e ao melhoramento.

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