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CARNEIRO, N. P.

DEUS, F. G.

GOMES, E. A.

MARRIEL, I. E.

OLIVEIRA, F. A. S. de

SILVA, P. G.

SILVA, V. L. dA

SOUZA, E. S.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2095 Isolamento de fungos mineralizadores de P ligado a fitato da rizosfera de milho adubado de maneira convencional ou orgânica  Emanuele S. Souza1, Flávia G. Deus1, Valdenia L. da Silva1, Patrícia G. Silva2, Newton P. Carneiro3, Eliane A. Gomes3, Flávia A. S. Oliveira1, Ivanildo E. Marriel3 e Andréa A. Carneiro3.  1Centro Universitário de Sete Lagoas, Sete Lagoas, MG. manutsouza@yahoo.com.br; flavinhagd@yahoo.com.br; valdenialopes@yahoo.com.br 2Departamento de Microbiologia - Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG – Belo Horizonte – MG patriciabio1@yahoo.com.br 3 Pesquisadores Embrapa Milho e Sorgo. Caixa Postal 151, Sete Lagoas, MG, 35701-970 newtonc@cnpms.embrapa.br; eliane@cnpms.embrapa.br; imarriel@cnpms.embrapa.br; andreac@cnpms.embrapa.br.  Palavras-chave: Zea mays, fungos, fitato, fósforo, rDNA.   Introdução  A aquisição de fósforo (P) é primordial para o crescimento e o desenvolvimento dos vegetais, desempenhando importantes papéis em funções fisiológicas básicas (RAGHOTHAMA, 1999). Do conteúdo de P no solo, apenas uma pequena quantidade, entre 0,1 e 10 µM (RAGHOTHAMA, 1999), está disponível na fase líquida. Para manter um crescimento saudável, plantas necessitam, no mínimo, entre 5 e 60 µM de P, dependendo da espécie (FÖHSE et al., 1988). Para resolver o problema da deficiência de P e manter um ótimo rendimento agrícola, mais de 30 milhões de toneladas/ano de fertilizantes fosfatados são adicionadas aos solos no mundo inteiro (INTERNATIONAL FERTILIZES INDUSTRY ASSOCIATION, 2006). Baseado no atual consumo de fertilizantes fosfatados, estima-se que as fontes de P estejam esgotadas dentro de aproximadamente 90 anos (RAGHOTHAMA, 1999; GÜSEWELL, 2004).  O P orgânico (Po) representa até 80% do total de P presente nos solos, sendo que 50% deste estão na forma de fitato. Esta forma de P orgânico parece ser utilizada apenas marginalmente pelas plantas (RICHARDSON et al., 2000). Para ser utilizado, o Po precisa ser hidrolisado através da atividade de enzimas fosfatases de origem microbiana ou vegetal. Uma grande variedade de fosfatases com diferentes especificidades tem sido caracterizada em raízes de plantas (BOSSE; KOCK, 1998) e microrganismos do solo (RICHARDSON, 1994). Estas incluem as fitases, que são enzimas capazes de catalisar a hidrólise de ligações fosfomonoéster do fitato, criando formas menos complexas de myo-inositol fosfato e fosfato inorgânico.  A contribuição de fosfatases, em especial as fitases, provenientes de raízes ou de microrganismos do solo, para a nutrição de plantas, tem sido pouco estuda em solos tropicais. Um aumento da atividade de fosfatases em resposta à deficiência de Pi e a ocorrência de atividade elevada na rizosfera, comparado com o solo livre de raízes, são considerados como evidências do envolvimento destas enzimas na nutrição de plantas (LI et al., 1997).  O objetivo deste trabalho foi a prospecção de fungos, presentes na rizosfera de milho adubado de maneira convencional ou utilizando resíduos orgânicos, capazes de utilizar fitato como fonte de P, visando a identificação de espécies com atividade de XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2096 fitase, potencialmente úteis como inoculantes, fontes de genes ou de enzimas para o bioprocessamento de fontes orgânicas de P.   Material e Métodos   Para o isolamento de microrganismos presentes na rizosfera de milho, foram coletadas amostras de solo rizosférico de plantas de milho cultivadas sob dois regimes de adubação: (i) milho proveniente de solo de cerrado, áreas experimentais da Embrapa Milho e Sorgo, adubado de maneira convencional (adubo inorgânico) e (ii) milho proveniente de solo de cerrado, Sete Lagoas, adubado com resíduo orgânico constituído de dejetos suínos. Amostras de 1 g de solo foram suspendidas em 9 ml de solução salina (NaCl, 0,85% p/v), agitadas em shaker durante 40 minutos e deixadas em repouso por 10 min em temperatura ambiente.   Para o isolamento dos microrganismos capazes de utilizar o fitato de sódio (Na-IHP) foram plaqueadas 0,1 ml de diluições seriadas decimais, em solução salina de 10-1 a 10-4, com três réplicas cada uma, no meio de cultivo sólido contendo fitato, com a seguinte composição por litro: 10 g Na-IHP, 10 g glicose, 0,5 g (NH4)2SO4,  0,2 g NaCl,  0,2 g  KCl,  0,1 g MgSO4.7H2O, 0,001 g MnSO4, 0,001 g FeSO4, 15 g ágar bacteriológico livre de resíduos de P (Sigma – MO – USA), suplementado com 20mM CaCl2. Neste meio, um halo é formado devido a utilização de Na-IHP pelos fungos. Todos os fungos capazes de crescer no meio Pikoviskaya sólido foram transferidos para o mesmo meio líquido (sem CaCl2). Discos de micélio de 3 mm da cultura sólida foram inoculados em frascos erlenmeyer de 125 ml contendo 25 ml  de meio  e incubados por 10 dias sob agitação constante em temperatura ambiente. Aqueles capazes de crescer em meio líquido foram caracterizados molecularmente através do sequenciamento de regiões do rDNA.    A amplificação da região ITS dos fungos selecionados foi feita, a partir do DNA total, utilizando os primers universais ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990). As amplificações foram realizadas empregando-se 25 ng de DNA genômico, 2,5 M de MgCl2 , 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 1,0 µl de dNTP, 50mM de KCl, 10mM Tris-HCl e 0,2 mM de cada oligonucleotídeo. A reação foi realizada em termociclador modelo (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) programado para uma desnaturação inicial de 4 minutos a 95ºC, seguido o ciclo de desnaturação 95ºC por 30 segundos, 46ºC por 1 minuto e 72ºC por 30 segundos, durante 25 ciclos, com uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese a 100 Volts por 2 horas, em gel de agarose 1,0% utilizando tampão TAE 1X (40 mM Tris-acetato; 1 mM EDTA, pH 8,0). As bandas amplificadas para os diversos microrganismos foram eluídas do gel utilizando o kit Gene Clean (Q-Bio Gene - USA). Em seguida, os fragmentos de 500 a 600 pb foram diretamente seqüenciados usando o kit ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Appliedd Biosystems -USA), de acordo com recomendações do fabricante. As sequências de nucleotídeos geradas foram comparadas com sequências depositadas no GenBank Nucleotide Database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) usando os programas BLAST (ALTSCHUl et al., 1997).  Resultados e Discussão   Com base na caracterização fenotípica das colônias em meio Pikoviskaya suplementado com CaCl2 foram isoladas 68 colônias diferentes de fungos, 37 provenientes de solo com adubação convencional e 31 de solos com adubação orgânica. XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2097 Todos os fungos isolados em meio sólido foram capazes de crescer em meio líquido utilizando fitato como fonte de P. Richardson e Hadobas (1997) sugeriram que o número de microrganismos determinados usando crescimento microbiano apenas em meio sólido é super-estimado com relação à proporção de microrganismos que realmente utilizam IHP. Segundo estes autores, é possível que esta discrepância seja, em parte, devido a presença no ágar de pequenas quantidades de Pi. Segundo instruções do fabricante, o ágar utilizado no presente trabalho não contém traços de P.   Dentre os fungos isolados da rizosfera de milho adubado convencionalmente foram encontrados os gêneros Aspergillus, Eupenicillium, Eurotiomyces Fusarium, Gibberella,  Paecilomyces e Penicillium. Da rizosfera de milho adubado com resíduos orgânicos foram isolados os gêneros Aspergillus, Bionectria, Cladosporium, Curvularia, Fusarium, Humicola, Paraphaeosphaeria, Penicillium, Pleioblastus, Neosartorya, Metacordyceps, Rhizopus  e Talaromyces (Tabela I). Apenas os gêneros Aspergillus, Fusarium e Penicillium foram comuns na rizosfera de milho adubado de maneira convencional ou orgânica. Sendo que uma maior variedade de gêneros de fungos capazes de crescer utilizando fitato como fonte de P foi encontrada na rizosfera de milho adubado com resíduos orgânicos. Nem todos os fungos isolados foram capazes de formar halo quando crescendo em meio sólido Pikoviskaya suplementado com CaCl2, provavelmente o mecanismo de obtenção de P a partir de fitato por estes organismos não seja o mesmo. Apesar das análises de formação de halo ainda estarem em andamento, dos 13 fungos analisados, isolados de solo com adubação convencional, 10 foram capazes de formar halo, enquanto 3 cresceram sem formação de halo. Já dos 19 isolados analisados provenientes de adubação orgânica, 11 cresceram sem formação de halo, enquanto 8 formaram halo (Tabela I).  Estudos de isolamento e caracterização de diferentes grupos de microrganismos que possuem atividade de fitase têm sido publicados. Gargova et al. (1997) avaliaram 203 fungos dos gêneros Aspergillus, Penicillim, Mucor e Rhizopus e selecionaram uma espécie de Aspergillus com alta eficiência de produção de fitase extracelular.  Poucos dados relacionados à colonização das raízes do milho por microrganismos mineralizadores de fosfato orgânico foram publicados. Hussin et al. (2007) fizeram um estudo de 249 bactérias isoladas de diferentes regiões da raiz do milho (rizosfera, halosfera e endofiticos) e as principais espécies identificados foram Staphylococcus lentus, S. xylosus, Bacillus cereus, B. subtilis, B. megaterium, B. mycoides, Brevibacillus laterosporus,  Kocuria varians.  Com base nos resultados apresentados, é possível concluir que a rizosfera do milho adubado de maneira convencional ou orgânica é colonizada por fungos capazes de utilizar fitato como única fonte de P. Futuros trabalhos, visando à quantificação da atividade de fitase e sua localização, intra ou extracelular, são necessários para a utilização eficiente destes microrganismos ou de seus genes para a geração de novas tecnologias, que reduzirão o custo da produção e o impacto ambiental da atividade agrícola.  Financiamento  Projeto financiado pelo CNPq, Fapemig e Embrapa   Referências   ALTSCHUL, S. F.; MADDEN, T. L.; SCHÄFFER, A. A.; ZHANG, J.; ZHANG, Z.; MILLER, W.; LIPMAN, D. J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2098 protein database search programs. Nucleic Acids Research, London, v. 25, p. 3389-3402, 1997.  BOSSE, D.; KÖCK, M. Influence of phosphate starvation on phosphohydrolases during development of tomato seedlings. Plant, Cell and Environmental, Oxford, v. 21, p. 325-332, 1998.  FÖHSE, D.; CLAASSEN, N.; JUNGK, A. Phosphorus efficiency of plants. Plant and Soil, Dordrecht, v. 110, n.1, p. 101-109, 1988.  GARGOVA, S.; ROSHKOVA, Z.; VANCHEVA, G.  Screening of fungi for phytase production. Biotechnology Techniques, v. 11, p. 221-224, 1997.  GÜSEWELL, S. N. P.  Ratios in terrestrial plants: variation and functional significance. New Phytologist,  Oxford, v. 164, p. 243-266, 2004.  GYANESHWAR, P.; KUMAR, G. N.; PAREKH, L. J.; POOLE, P.S. Role  of soil microorganisms in improving P nutrition of plants. 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Isolado # Acesso BLAST Espécie BLAST  % Identidade Crescimento em Fitato Formação de Halo em Fitato Adubação Convencional CNPMS 29 EF661550.1 Aspergillus caelatus  97 + +++ CNPMS 39 EF661550.1 Aspergillus caelatus   97 + +++ CNPMS 38 EF661550.1 Aspergillus caelatus  97 + ND CNPMS 45 EF661550.1 Aspergillus caelatus  96 + +++ CNPMS 42 EF661550.1 Aspergillus caelatus  96 + ND CNPMS 36 EF661550.1 Aspergillus caelatus  96 + +++ CNPMS 22 EF661550.1 Aspergillus caelatus  96 + +++ CNPMS 20 EF661550.1 Aspergillus caelatus  98 + - CNPMS 44 GU566242.2 Aspergillus fumigatus  94 + ND CNPMS 04 GU205082.1 Aspergillus fumigatus 94 + ND CNPMS 31 GQ153050.1 Aspergillus niger  94 + ND CNPMS 34 EU3016601.1 Aspergillus niger  96 + ND XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2100 CNPMS 26 EF661568.1 Aspergillus parasiticus  97 + +++ CNPMS 48 AF033420.1 Eupenicillium sheariI  96 + ND CNPMS 08 EU427292.1 Eupenicillium tropicum  99 + - CNPMS 35 GQ153050.1 Eurotiomyces sp  98 + ND CNPMS 28 GQ153050.1 Eurotiomycetes sp  97 + - CNPMS 19 GQ153050.1 Eurotiomycetes sp  89 + ND CNPMS 40 X94177.1 Fusarium dlaminii  96 + +++ CNPMS 24 GU055307.1 Gibberella moniliformis  96 + ND CNPMS 27 GU982311.1 Gibberella moniliformis 95 + +++ CNPMS 23 GU480956.1 Gibberella moniliformis  96 + ND CNPMS 21 EU306174.1 Paecilomyces lilacinus 95 + ND CNPMS 43 FN598940.1 Paecilomyces lilacinus  94 + ND CNPMS 46 FN394534.1 Penicillium sp  90 + ND CNPMS 02 GU017516.1 Penicillium sp  97 + ND CNPMS 03 GU017516.1 Penicillium sp  99 + ND CNPMS 06 FJ795356.1 Penicillium sp 98 + ND CNPMS 10 GQ184733.1 Penicillium sp  98 + ND CNPMS 33 GU566273.1 Penicillium citrinum  96 + +++ CNPMS 25 GU566273.1 Penicillium citrinum  97 + ND CNPMS 11 AJ509865.1 Penicillium ochrochloron  97 + ND CNPMS 37 AF176660.1 Penicillium pinophilum  97 + +++ CNPMS 14 GU566216.1 Penicillium pinophilum  98 + ND CNPMS 16 GU566216.1 Penicillium pinophilum  98 + ND CNPMS 17 GU566216.1 Penicillium pinophilum  91 + ND   Adubação Orgânica    CNPMS 373 GQ229082.1 Aspergillus versicolor  99 + - CNPMS 376 GU566253.1 Bionectria ochroleuca  98 + - CNPMS 423 GU566253.1 Bionectria ochroleuca  89 + ND CNPMS 412 FJ025204.1 Bionectria ochroleuca  92 + ND CNPMS 380 GU214631.1 Cladosporium sp  98 + - CNPMS 369 EF405864.1 C. cladosporioides  98 + - CNPMS 392 GQ184733.1 Curvularia sp  95 + - CNPMS 366 GQ229075.1 Fusarium solanii  99 + ND CNPMS 379 GU183113.1 Humicola fuscoatra 95 + ND CNPMS 386 EF029814.1 Paraphaeosphaeria sp  97 + - CNPMS 396 FJ795356.1 Penicillium sp  98 + +++ CNPMS 409 FJ827621.1 Penicillium sp  92 + ND CNPMS 372 GU566273.1 Penicillium citrinum  98 + + CNPMS 407 GQ337426.1 Penicillium funiculosum  96 + +++ CNPMS 388 GQ924903.1 Penicillium pimiteouiense  97 + - CNPMS 398 GU566216.1 Penicillium pinophilum  98 + ND CNPMS 395 GU566216.1 Penicillium pinophilum  97 + +++ CNPMS 382 EU833225.1 Penicillium purpureum  96 + - CNPMS 375 EU833225.1 P.  roseopurpureum  97 + - CNPMS 394 EU579531.1 P.  cf. verruculosum  96 + +++ CNPMS 374 GU721652.1 Pleioblastus chino  98 + + CNPMS 389 EF669952.1 Neosartorya aureola  95 + - CNPMS 403 EF669952.1 Neosartorya aureola  96 + - CNPMS 390 EF669952.1 Neosartorya aureola  97 + ND CNPMS 422 GU827482.1 Metacordyceps sp.  91 + ND CNPMS 397 AF543520.1 Rhizopus arrhizuS 84 + ND CNPMS 402 EU273527.1 Talaromyces flavus 96 + ND CNPMS 415 EU273527.1 Talaromyces flavus  95 + ND CNPMS 404 AF455513.1 Talaromyces flavus 97 + +++ CNPMS 378 EU273527.1 Talaromyces flavus  96 + +++ CNPMS 423 EU273527.1 Talaromyces flavus  90 + ND  ND: não determinado XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 2101   

Isolamento de fungos mineralizadores de P ligado a fitato da rizosfera de milho adubado de maneira convencional ou orgânica.

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