CARNEIRO, N. P.

VASCONCELOS, V. D. B.

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Transformação genética de milho com construções gênicas contendo o gene AtDREB2A visando tolerância à seca¹  Vanessa Diniz Barcelos Vasconcelos2, Newton Portilho Carneiro3  1 Trabalho financiado pelo CNPq/Fapemig 2 Estudante do Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário de Sete Lagoas, Bolsista PIBIC do Convênio Fapemig/CNPq/Embrapa/ FAPED 3 Pesquisador da Embrapa Milho e Sorgo   Introdução  O milho, uma das culturas mais antigas do mundo, é considerado hoje a terceira cultura mais importante no mundo, não só pelo seu valor nutritivo, mas também economicamente (DUARTE et al., 2008). Em termos de área semeada e de produção de grãos é o segundo cereal mais importante no Brasil (VILARINHO, 2005).   As alterações climáticas, como a seca, acarretam grandes problemas na cultura do milho. Esse cereal, apesar de tolerar temperaturas de até 30˚C, necessita de uma boa irrigação, pois absorve uma quantidade alta de água por dia. O déficit hídrico faz com que o intervalo da emergência do pendão até o aparecimento dos estigmas aumente de três a quatro dias fazendo com que, por falta de polinização, se desenvolvam espigas estéreis ou com poucos grãos. Há a inibição do alongamento do estilete e o retardamento na emergência dos estigmas, que fazem com que estes fiquem menos expostos à polinização. A seca acarreta ainda a diminuição no número de grãos por espigas no milho. Considerando a importância da cultura do milho, a necessidade de essa cultura atingir regiões remotas de pouca água e os efeitos climáticos que podem influenciar as precipitações anuais, tornam-se extremamente importantes estudos de mecanismos de tolerância à seca nessa planta como solução de parte desses problemas. Dentre esses estudos para amenizar o déficit hídrico, deve-se aumentar a irrigação nas plantações agronômicas e desenvolver mecanismos morfofisiológicos, que conduz as plantas a economizar água para uso em períodos posteriores.  A engenharia genética ganha importância para o desenvolvimento de plantas geneticamente modificadas sendo uma solução alternativa para os grandes produtores de todo o mundo. Pesquisadores do JIRCAS descobriram o gene DREB2A (Dehydration Responsive Elements Binding protein) que, ao ser introduzido à planta, possibilita uma tolerância a ambientes mais secos e de maior salinidade. Esse trabalho tem por objetivo testar a hipótese de superexpressar o gene DREB2A em milho e verificar o seu efeito em condições de estresse hídrico.    Material e Métodos  O genótipo utilizado para transformação foi o A188. As sementes foram plantadas a cada 7 dias e depois de 60 dias elas foram autofecundadas. Após 10 dias, as espigas foram retiradas com água sanitária diluída 50% por 10 minutos e os embriões foram retirados e colocados em meio de cultura conforme Tabela 1.   Os plasmídeos utilizados foram: 1) pBRACT 309 DREB2A CA; 2) pBRACT 302 35S DREB2A CA e;  3) pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA (Figura 1). As bactérias Escherichia coli contendo esses plasmídeos foram estriadas em placas contendo meio LB sólido contendo antibiótico Canamicina (100 ug/mL) e incubadas por 18 h a 37ºC. Colônias isoladas dessas 3 bactérias foram crescidas individualmente em 2 ml de LB líquido contendo Canamicina na mesma concentração e incubadas por 18 h a 37ºC com agitação. No dia seguinte foi extraído os plasmídeos dessas bactérias conforme o Alkaline Lysis Miniprep (AUSBEL et al., 1998).   Figura 1: Plasmídeo pBract302 contendo a construção gênica promotor+DreB+Terminador  Após a extração de plasmídeos foi feita a clivagem com enzima de restrição. Para a clivagem foi realizado o seguinte processo: 1 µL de enzima de restrição (EcoRI, BamHI e HindIII – 10 U/uL), 1 µL de tampão, 2 µL  de plasmídeo (200 ng/ul - Nanodrop) e 6 µL de água. Posteriormente, a reação foi colocada em banho-maria por uma hora a 37ºC e submetida à eletroforese em gel de agarose 1% a 100 V com tampão TBE 1 X por 1 hora, corado com brometo de etídio e visualizado em UV. Os géis foram digitalizados. A extração do plasmídeo para a transformação foi realizada através do Max Prep Plasmidial (QIAGEN).   O bombardeamento foi feito com embriões de 1 mm a 2 mm posicionados com o eixo embrionário em contato com o meio. O meio de cultura no momento em que é feita a retirada dos embriões é o meio IC que contém basicamente sais, vitaminas, carboidrato e água. A replicagem de calo é feita apenas das regiões embriogênicas saudáveis.   A concentração dos plasmídeos foi de 1 ug/uL com a aplicação de 5 a 8 µL em cada bombardeamento. Os embriões foram incubados no meio IC por uma semana e transferidos para meio de seleção (SE+3ppt) por duas semanas. Após esse período os embriões foram transferidos para novas placas com o mesmo meio de seleção anterior.  Como controle, embriões não bombardeados passaram pelos mesmos meios de seleção.  Como teste, foi também bombardeado calos do genótipo HI II com o plasmídeo pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA, submetido os mesmos procedimentos que os embriões transformados.    Resultados e Discussão Os resultados de clivagem dos plasmídeos estão conforme descrito na figura 2.   Figura 2 – Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio com os plasmídeos. pBRACT 309 DREB2A CA; 2) pBRACT 302 35S DREB2A CA e;  3) pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA, clivados com as enzimas EcoRI, BamHI e HindIII.  M =  marcador molecular de 1 kb, E = EcoRI, B = BamHI; H = HindIII, N = plasmídeos não clivados  Foram realizados 10 experimentos até o momento, sendo que os 5 que estão no estágio mais avançado se encontram na tabela 1. Quadro de Materiais de A188 Transformados por Biobalística Data  Bomb. Explante Plasmídeo Meio IC Meio SE+3ppt Meio SE+6ppt Meio RM+3ppt Data Nº Placas Data 1ª trans Nº Placas Data 2ª trans Nº Placas Data 1ª trans Nº Placas Data 2ª trans Nº Placas Data Nº Calos  18/11/2009 Embrião  pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA   19/11/2009     30  17/12/20 09     97   04/01/2010 156  ---------------   -----------  --------------  ---------  22/02/2010     35   26/11/2009 Embrião   pBRACT 309 DREB2A CA  27/11/2009     37  11/12/2009     109  04/01/2010  223  ---------------  -----------  --------------  ----------  18/02/2010     48   05/10/2009 Calo   pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA   05/10/2009     49 13/10/2009     106 --------------  ----------  30/10/2009      320  13/11/20 09      498 07/01/20 10     136  05/10/2009 Calo   pBRACT 302 35S DREB2A CA  05/10/2009    31   13/10/20 09     84  -----------------  ----------   30/10/2009      197   13/11/20 09     304  07/01/20 10     104   06/10/2009  Calo  pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA  07/10/2009      15  14/10/2009     53  -----------------  -----------  28/10/2009       139  11/11/20 09      299 07/01/20 10      16    Tabela 1: Quadro com a relação das transformações de A188 em estágios mais avançados. 5 dos 10 realizados. Cada placa corresponde a 25 explantes.  Verifica-se um melhor interesse de experimentos com o plasmídeo pBRACT 302 Zm Rab17Pro DREB2A CA, intermediário com o pBRACT 309 DREB2A CA, e um menor interesse ao plasmídeo pBRACT 302 35S DREB2A CA, devido à região promotora, que é justamente o que os diferenciam. Sendo o 35S um promotor constitutivo, o ZmDREB2A acumula em plantas em resposta estresses de frio, desidratação, salinidade e calor.    Conclusão  Possíveis resultados positivos foram observados em calos crescendo em meio seletivo. Após a conformação dessa seleção, esse calos serão submetidos a meio de maturação e transferidos para cada de vegetação. As plantas T0 serão autofecundadas e parte das sementes usadas na fenotipagem. DNA das plantas T0 serão analisadas quanto a presença do gene.    Referências  AUSBEL, F. M; BRENT, R.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J. G.; SMITH, J. A.; STRUHL, K. Current protocols in molecular biology. Massachusetts: Jonh Wiley & Sons, 1998.   DUARTE, J. de O.; CRUZ, J. C.; GARCIA, J. C.; MATTOSO, M. J. Economia da produção. In: CRUZ, J. C. (Ed.). Cultivo do milho. 4. ed. Sete Lagoas: Embrapa Milho e Sorgo, 2008. (Embrapa Milho e Sorgo. Sistema de producao,2).  SANTOS, R. F.; CARLESSO, R. Déficit hídrico e os processos morfológico e fisiológico das plantas. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental, Campina Grande, v. 2, n. 3, p. 287-294, 1998.   VILARINHO, A. A. Densidade e espaçamento como fatores de produtividade na cultura do milho. 2005. Disponível em: <http://www.agronline.com.br/artigos/artigo.php?id=237>. Acesso em: 27 fev. 2010. 

Transformação genética de milho com construções gênicas contendo o gene AtDREB2A visando tolerância à seca.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/855255/1/Transformacaogenetica.pdf

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