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MIRANDA, G. V.

RIBEIRO, P. E. de A.

ROCHA, M. C. da

RODRIGUES, F.

RODRIGUES, J. A. S.

SCHAFFERT, R. E.

SILVA, L. A.

TARDIN, F. D.

VASCONCELOS, M. J. V. de

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Avaliação de Linhagens de Sorgo Cultivadas em Estresse de Fósforo para a Liberação deCompostos RadicularesMichel C. da Rocha1, Glauco V. Miranda2, Lidianne A. Silva3, Fabrício Rodrigues3, GeraldoA.C. Júnior3, Paulo E.A. Ribeiro4, Flavio D. Tardin5, José A. Rodrigues5, Maria J.V.Vasconcelos5 e Robert E. Schaffert51Mestrando em Fitotecnia, UFV, e Bolsista Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas-MG,michelcastelani@yahoo.com.br, 2Professor Associado UFV, 3Bolsista Embrapa Milho e Sorgo,UFV, 4Analista Embrapa Milho e Sorgo, 5Pesquisador Embrapa Milho e Sorgo.Palavras-chave: Sorghum bicolor, estresse abiótico, morfologia de raiz, mecanismos deadaptação, aquisição de fósforo.Durante o processo natural de evolução, as plantas de sorgo desenvolveram mecanismosde adaptação para uma gama de condições ambientais, resultando em uma extensa variaçãogenética para tolerância a diversos estresses (Tuinstra et al., 1997). O sorgo, apesar de ser umaimportante cultura do agronegócio nas regiões do cerrado e do nordeste, apresenta variabilidadena absorção de fósforo em solos pobres neste elemento.As plantas apresentam vários mecanismos e processos que contribuem para o usoeficiente dos nutrientes que se encontram pouco disponíveis no solo. Esses mecanismos eprocessos estão relacionados com a expressão de características morfológicas e fisiológicasdesejáveis (Fageria, 1998). A exsudação radicular de compostos orgânicos e associaçãosimbiótica com fungos micorrízicos são estratégias ligadas aos mecanismos fisiológicosdesenvolvidos pelas plantas para aumentar a absorção de fósforo (Nagahashi et al., 2000). Oaumento da absorção de nutrientes com pouca mobilidade na solução do solo, particularmentefósforo, devido às associações micorrízicas, ocorrem por meio da exploração de um maiorvolume de solo, da solubilização de fosfatos orgânicos pelas fosfatases produzidas pelas hifas epela mobilização de fósforo inorgânico (Yao et al., 2001). Segundo Czarnota et al. (2003), existeconsiderável diferença na quantidade e na qualidade de exsudados produzidos pelas raízes desorgo, havendo indicações de diversidade genética para a produção desses exsudados.Entre os compostos liberados pelas plantas como estratégias para adaptação em ambientesde baixo fósforo estão os ácidos orgânicos, que possuem a capacidade de atuar favorecendo asolubilização de fósforo e as estrigolactonas, que são compostos sinalizadores para colonizaçãode micorrizas (Akiyama et al., 2005).A sorgolactona é uma estrigolactona que foi identificada nos exsudados radiculares desorgo (Hauck et al., 1992) e possui grande efeito estimulatório sobre o desenvolvimento defungos arbúsculo-micorrízicos (AM). Desta forma, acredita-se que o aumento da ramificação edo comprimento de hifas, e a germinação de esporos são conseqüências fisiológicas dessaestimulação metabólica ocasionada pela ação da sorgolactona (Besserer et al., 2006). Estesefeitos contribuem para o aumento da colonização das raízes que exsudam maiores quantidadesdeste composto por fungos AM (Nagahashi et al., 2000).Os objetivos deste trabalho foram adaptar metodologia para crescimento das plantas ecoleta de exsudados radiculares e caracterizar linhagens de sorgo quanto à exsudação radicular decompostos produzidos quando cultivadas em estresse de fósforo.Foram avaliadas quatro linhagens de sorgo (L1, L2, L3 e L4), com três repetições,crescidas em sistema de cultivo acrescido de solução nutritiva sem fonte de fósforo, em câmarade crescimento na Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas-MG. Oitenta sementes de cada linhagemde sorgo foram transferidas para cada um dos sistemas de cultivo formado por um funil debuchner de 15 cm de diâmetro esterilizado contendo lã de vidro umedecida com 100 mL de águadestilada, sendo este funil encaixado em um kitasato de 500 mL. Os exsudados foram coletadosaos 14, 15 e 16 dias de cultivo, em intervalos de 24 horas. Para coleta, a lã de vidro foi lavadacom 150 mL de água destilada e, com auxílio de uma bomba de vácuo, o extrato foi transferidopara o kitasato.Os exsudados radiculares foram extraídos do meio aquoso por partição, utilizando 50 mLde acetato de etila. Após agitação e separação, a fase orgânica foi recolhida e reservada. Esseprocedimento foi repetido por três vezes. Em seguida, os três extratos de acetato de etila foramreunidos, evaporados em evaporador rotativo com banho a 23 °C e estocados em freezer a -20 °C.Em seguida, os exsudados totais dos dias 14, 15 e 16 foram dissolvidos em acetonitrila,misturados, evaporados e quantificados por pesagem para determinação de exsudados totaisliberados por cada linhagem. Os extratos de cada linhagem foram dissolvidos em 3 mL de umamistura água:acetonitrila (AcN) (70:30, v/v) e separados em seis frações utilizando cartuchos C18Mega Bond Elut (Varian) de 6 mL, usando gradiente de concentração de AcN como fase móvel(Besserer et al., 2006). Os compostos presentes na fração 6 (onde foi encontrada sorgolactona porBesserer de cada linhagem foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência(CLAE/HPLC) em cromatógrafo marca Shimatzu, modelo LC10A, utilizando coluna de fasereversa C18 Hypurity Elite (Hypersil) com 25 cm X 4.6 mm X 5 µm de diâmetro de poro.  Aseparação ocorreu por meio de um gradiente de 70:30 H2O:AcN para 100% AcN em um fluxoconstante de 600 µL/min. Foi necessário adaptar a metodologia de Besserer, aumentando o fluxode 200 µL/min para 600 µL/min para evitar a formação de bolhas, o que resultou em redução dotempo de retenção. Devido ao fato de não se possuir o padrão de sorgolactona, realizou-se osprocedimentos de separação da Fração 6 seguindo os procedimentos utilizados por Besserer et al.,(2006), sendo alterado apenas o fluxo de eluição das amostras. Assim, com base no tempo deretenção do padrão de sorgolactona (40 minutos) e do perfil cromatográfico da fração 6 deamostra, encontrados por este autor, identificou-se a região do cromatograma onde possivelmentese encontra a sorgolactona nas frações 6 das amostras (35 minutos). Com isto, verificou-se quedevido ao maior fluxo utilizado nas análises dos tratamentos, houve uma diferença de 5 minutosna eluição dos compostos quando comparados com o encontrado por Besserer et al. (2006).Depois de identificar esta região, foi preparada uma mistura teste (MT), com maiorquantidade de exsudados, a partir de coletas realizadas em outro experimento executado nasmesmas condições citadas, porém utilizando 4 repetições e 3 coletas, em intervalos de 24 horas.A fração 6 desta MT foi aplicada no HPLC e uma alíquota foi coletada na região de 26 a 40minutos para tentativa de confirmação de sorgolactona em análise de cromatografia gasosaacoplada a espectrômetro de massas. Em seguida, 5 µL desta alíquota da MT e das frações 6 dostratamentos foram analisadas em cromatógrafo a gás da marca Shimatzu, modelo QP2010plus,acoplado a espectrômetro de massas (GC/MS). As amostras, de cada linhagem, foram secas emrotavapor e diluídas para 3 mL de acetonitrila, sendo que destes foi injetado 5 µL em uma colunacapilar DB-5 (30 m x 0,25 mm) utilizando gás hélio como carreador.  A temperatura inicial dacoluna foi de 130 ºC nos primeiros 1,5 min, elevada para 270 ºC em uma taxa de 16 ºC por min,permanecendo nesta temperatura por 5 min.Pode-se verificar que houve diferenças significativas entre os valores de exsudados totaisliberados pelas plantas de sorgo cultivadas em estresse de fósforo (Figura 1). Das quatrolinhagens estudadas, a L1 foi a que apresentou maiores quantidades de exsudados totais, sendoque ela foi 2,8 vezes maior que a L3, que menos exsudou. Isto indica que há diferenças nasrespostas fisiológicas das linhagens de sorgo estudadas quando cultivadas em estresse de fósforo,confirmando, portanto, que há variabilidade genética para a exsudação de compostos em sorgocultivado em estresse de fósforo, conforme observado também por Czarnota et al. (2003).000,0E+02,0E-64,0E-66,0E-68,0E-610,0E-612,0E-614,0E-616,0E-618,0E-6L3 L4 L2 L1LinhagensExsudados Totais Seco (g/planta/72horas)Figura 1 – Quantidade de exsudados totais liberados por plantas de sorgo aos 14, 15 e 16 dias de cultivo (72 horas)em estresse de fósforo. As diferenças nas repostas fisiológicas apresentadas pelas linhagens são evidentes pelasuperior quantidade de exsudados totais apresentadas pela L1 sobre as demais.A análise dos compostos separados pela cromatografia gasosa da alíquota coletada notempo de 26 a 40 minutos da MT (analisada em HPLC) e das linhagens cultivadas em estresse defósforo pelo espectrômetro de massas nos indicou um pico na região eluída no tempo de 6,8minutos como provavelmente um fragmento de estrigolactona. O espectro de massas docomposto eluído neste tempo apresentou um pico molecular 97 m/z de intensidade de 30 %,indicando a possibilidade de presença de um fragmento estável (anel D) presente nasestrigolactonas. As moléculas de estrigolactonas apresentam uma fácil hidrólise da ligação dosanéis C e D (Akiyama et al., 2005) sendo a alta temperatura usada no processo de separação porcromatografia gasosa capaz de fragmentar essas moléculas de estrigolactonas. Como o anel Dpossui considerável estabilidade, pode ser identificado em GC/MS (Yokota et al., 1998).Com base na intensidade dos picos no tempo de 6,8 minutos verifica-se que houvediferenças na quantidade encontrada do composto eluído neste tempo para as linhagens de sorgo.A L1 foi a que apresentou maior quantidade do composto sendo, entretanto, pouco superior a L2.A L3 apresentou quantidades um pouco menor, mas ainda assim, superior a L4, que apresentouuma quantidade eluída tão pequena que o sistema de cromatografia não foi capaz de integrar oseu pico cromatográfico. Segundo Rich et al., (2004) a L4 é tolerante a Striga, uma daninhaparasítica muito comum nas regiões da África e que apresentam germinação estimulada pelaliberação de estrigolactonas (Besserer et al., 2006). Assim, era esperado que esta linhagemproduzisse pouca ou nenhuma estrigolactona, o que condiz com o encontrado para o compostoeluído no tempo de 6,8 minutos, aumentando assim a probabilidade deste composto ser ofragmento de estrigolactonas. Trabalhos realizados na Embrapa Milho e Sorgo mostram quelinhagens de sorgo apresentam colonização por micorrizas de forma diferenciada, indicando umavariação na liberação dos compostos sinalizadores (estrigolactonas) em sorgo cultivados emestresse de fósforo (comunicação pessoal).A metodologia adaptada se mostra eficaz para o crescimento das plantas e coleta dosexsudados radiculares de plantas de sorgo, podendo ser empregada rotineiramente nos programasde pesquisa e melhoramento. A L1 apresenta-se superior as outras três linhagens testadas emrelação à exsudação total de compostos, indicando a existência de resposta fisiológicadiferenciada entre estas linhagens quando cultivadas em estresse de fósforo. Para a caracterizaçãoe quantificação das estrigolactonas presente nos exsudados radiculares de sorgo é fundamental autilização de compostos purificados como padrões nas análises cromatográficas. Os resultadosobtidos em cromatografia gasosa indicam a existência de variabilidade genética entre aslinhagens de sorgo cultivadas em estresse de fósforo para exsudação de compostos relatadoscomo sinalizadores (estrigolactonas) para a colonização de fungos micorrízicos.Referências Bibliográficas:Akiyama K, Matsuzaki K, Hayashi H (2005) Plant sesquiterpenes induce hyphal branching inarbuscular mycorrhizal fungi. Nature 435: 824-827.Besserer A, Puech-Pagès V, Kiefer P, Gomez-Roldan V, Jauneau A, et al. (2006) Strigolactonesstimulate arbuscular mycorrhizal fungi by activating mitochondria. Plos Biology 4(7): e226.DOI:10.1371/journal.pbio.0040226.Czarnota MA, Rimando AM, Weston LA (2003) Evaluation of seven Sorghum (Sorghum sp.)acessions. Journal Chemical Ecology 29:2073-2083.FAGERIA, N. K. 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Avaliação de linhagens de sorgo cultivadas em estresse de fósforo para a liberação de compostos radiculares.

Avaliação de linhagens de sorgo cultivadas em estresse de fósforo para a liberação de compostos radiculares.

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