FERREIRA, C. A.

GUIMARAES, C. T.

PINHO, E. V. R. von.

PINHO, R. G. von.

SALGADO, K. C. P. C.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Mapeamento de QTLs Associados Com a Tolerância de Sementes de Milho à AltaTemperatura de SecagemKalinka, C.P.C.S.; Édila, V.R.V.P.; Cláudia,T.G.; Renzo, G.V.P. e Ferreira, C.A. Universidade Federal de Lavras, Departamento de Agricultura, Cep. 37.200-000, Caixapostal 37, Lavras-MG. E-mail: kaka@ufla.br; edila@ufla.br; claudia@cnpms.embrapa.br;renzo@ufla.br; clarissaaf04@yahoo.com.brPalavras-chave: Zea mays, temperatura de secagem, QTL, sementes, marcador molecular.A colheita de sementes de milho em espiga favorece a antecipação da mesma econsequentemente a viabilização das estruturas de beneficiamento e de secagem. Além disso,esse método permite que as sementes sejam colhidas mais próxima ao ponto de maturidadefisiológica e com máxima qualidade. Porém, sementes colhidas em espigas, com altos teoresde água, podem sofrer danos no processo de secagem. Segundo José et al. (2004b), asusceptibilidade da semente aos danos de secagem depende dentre outros fatores do genótipo.Porém, o processo de tolerância a altas temperaturas de secagem é complexo e poucocompreendido, requerendo estudos mais detalhados para possibilitar a aplicação emprogramas de melhoramento.Grande parte dos trabalhos de melhoramento genético que tem utilizado marcadoresmoleculares é priorizada para caracteres de herança simples, uma vez que as variaçõesfenotípicas são de fácil mensuração e análise (Lanza, 2000). Entretanto, a maioria dascaracterísticas de importância econômica em milho é classificada como poligênicas ouquantitativas (Stuber, 1995).Ao contrário da pré-suposição de que características quantitativas são influenciadaspor muitos genes de pequeno efeito, Lande (1981) sugeriu que poucos genes poderiamexplicar uma proporção relativamente grande da variação genética para característicasquantitativas. Tais genes de efeito maior, são conhecidos como QTL (Quantitative Trait Loci- caracteres de herança quantitativa) e, algumas vezes não podem ser localizadosindividualmente. Porém, é possível a localização da região do genoma em que estes locospodem estar presentes, bem como estimar o quanto tais locos contribuem para a variação totaldo fenótipo.Um grande número de genes com um efeito potencial tanto na termotolerância quantona tolerância de plantas e sementes a estresse hídrico têm sido descritos, sendo que um maiorentendimento das respostas moleculares a esses estresses tem sido obtido por meio daavaliação de tais genes. Além disso, as regiões genômicas onde se encontram os locoscontroladores dessas características vêm sendo alvo de diversos estudos, visando oconhecimento da magnitude dos efeitos e as interações desses genes ou QTLs.Procurou-se nessa pesquisa identificar QTLs, bem como  a ação genética equantificação dos efeitos dessas regiões na variação fenotípica da tolerância de sementes aalta temperatura de secagem.A presente pesquisa foi desenvolvida na área experimental e no Laboratório de Análisede Sementes do Departamento de Agricultura da Universidade Federal de Lavras, Lavras, MGe no Núcleo de Biologia Aplicada da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG.As linhagens de milho LE12 e LE5, com sementes intolerantes e tolerantes a secagema alta temperatura, respectivamente, foram cruzadas para a obtenção de uma população F2:3.Cada planta individual foi identificada e foram coletadas folhas que ficaram armazenadas a -80 oC . As sementes foram colhidas quando apresentavam teor de água de 35% e secadas a 45oC, usando um secador de acordo com o modelo descrito por Rosa (2000).Após a secagem as sementes foram avaliadas quanto à tolerância a dessecação peloteste de envelhecimento acelerado de acordo com o trabalho de José et al. (2004a). Os ensaiospara a avaliação de microssatélites e as análises de ligação dos marcadores foram descritospor Salgado et al. (2005). O mesmo mapa de ligação foi usado no presente trabalho. Para omapeamento do QTL, os dados moleculares e os resultados de vigor observados no teste deenvelhecimento acelerado foram associados por meio do modelo de regressão simples,utilizando o programa QTL Cartographer para Windows versão 1,21 (Basten et al., 2000),sendo que as associações foram consideradas significativas a um nível de probabilidade P <0,01 e o coeficiente de determinação (r2) foi interpretado como a estimativa da proporção davariância fenotípica explicada por cada marcador.O mapeamento por intervalo composto (Zeng, 1994) foi realizado utilizando asinformações do mapa de ligação e o programa QTL Cartographer para Windows versão 1,21(Basten et al., 2000). O intervalo de precisão foi de 1 cM, com uma distância de 10 cM paracontrolar a interferência de múltiplos QTLs por meio de modelos de regressão backward eforward. A localização do QTL mais provável foi estimada pela função verossimilhança,sendo plotada uma curva em valores de LR para cada cM do genoma mapeado. O limite designificância foi determinado utilizando-se 1000 permutações ao acaso dos dados fenotípicos(α = 0,05), segundo Doerge & Churchill (1996).A ação gênica de cada QTL detectado foi determinada por meio das estimativas dograu de dominância (d/[a]) e classificadas segundo o critério proposto por Stuber et al. (1987):aditivo (A) = 0 a 0,20; dominância parcial (DP) = 0,21 a 0,80; dominância (D) = 0,81 a 1,20 esobredominância (OD) > 1,20.Apenas os marcadores que foram mapeados nos grupos de ligação gerados peloprograma Gqmol foram utilizados nesse processo de mapeamento. Os marcadores que não seligaram a nenhum grupo foram excluídos dessa análise, o que levou à utilização de somente39 marcadores na análise de intervalo composto.Os marcadores não ligados puderam ser avaliados pela análise de regressão linearsimples. Desses marcadores, somente para o umc1029, localizado no bin 7.04 houve umaassociação significativa entre o marcador e QTL. Os demais marcadores significativamenteassociados à QTLs pela análise de regressão linear simples se encontram agrupados nosgrupos de ligação que foram utilizados na análise de intervalo composto.Por meio do mapeamento por intervalo composto, foram mapeados três QTLsassociados com a tolerância de sementes de milho à alta temperatura de secagem, sendoestimadas suas contribuições na variância fenotípica, seus efeitos e ação gênica.Pela análise de intervalo composto, os QTLs explicaram conjuntamente 39% davariação fenotípica quanto à tolerância à alta temperatura de secagem. Considerando o graude dominância (d/[a]) dos três QTLs detectados, observa-se que foram detectados efeitosaditivos, de dominância e de sobredominância. Tais resultados estão de acordo com José et al.(2004b), que observaram efeitos da capacidade geral (CGC) e específica (CEC) decombinação, bem como efeitos recíprocos significativos para a tolerância à alta temperaturade secagem, indicando a presença de genes de efeitos aditivos e não aditivos no controlegenético para essa característica, tendo sido os efeitos genéticos aditivos mais importantes nadeterminação do caráter.Na posição 6.05 do cromossomo 6, foi identificado um QTL ligado ao marcadornc013, explicando 10,61% da variância fenotípica. Esse QTL apresenta efeito dominante e osinal negativo do efeito aditivo indica que o alelo favorável foi doado pelo genitor intoleranteà alta temperatura de secagem (Tabela 1). No mesmo cromossomo, mas no bin 6.08 ligado aomarcador umc2059, foi identificado um QTL explicando 10,27% da variância fenotípica dacaracterística, com um efeito de dominância para a expressão do fenótipo. O terceiro QTL foimapeado na posição 8.05, próximo ao marcador phi014. Esse QTL explicou 14,10% davariação fenotípica, possuindo um efeito de sobredominância.TABELA 1 - Posição, porcentagem de variância fenotípica (Vf), efeitos e ação gênica dosQTLs associados à tolerância de sementes de milho à alta temperatura desecagem, por meio do mapeamento de intervalo composto e regressão simples.UFLA, Lavras, MG, 2005.Mapeamento por intervalo compostoLR Efeitos gênicosMarca simplesBinMarca Signi-ficânciaMáximaVf(R2) a d (d/a) F Prob. Vf(R2)Açãogênica6.05 Nc0013 11.35 11.79 10.61 -17.62 15.77 0.89 7.75 0.006** 7.63Domi-nante6.08 umc2059 8.72 10.27 10.05 17.69 4.11 0.22 10.26 0.002** 9.97 Aditivo8.05 phi014 8.64 9.70 14.1 12.21 23.64 1.9 6.27 0.02* 5.36 Sobredo-minante** significativo a 1% de probabilidade;*   significativo a 5% de probabilidade;LR: razão da verossimilhança.Significância: limite determinado por 1.000 permutações ao acaso dos dados fenotípico para cada cromossomo.r2: proporção da variância fenotípica explicada pelo QTLa: efeito aditivo; d: efeito de dominância; d/[a]: grau de dominânciaPela análise de marcas simples, os marcadores nc013 e umc2059, localizados nocromossomo 6, explicaram 7,63% e 9,97% da variação fenotípica, respectivamente. Já omarcador phi014, localizado no cromossomo 8, explicou 5,36% da variação fenotípica datolerância (Tabela 1). Pelos resultados apresentados, observa-se que os valores da variânciafenotípica desses marcadores obtidos pela análise de marca simples foram mais baixos que osobservados pela análise de intervalo composto, indicando que essa última análise possui ummaior poder de estimativa dos efeitos dos QTLs.Esses marcadores parecem estar efetivamente associados com a característica avaliada,uma vez que todos se encontram mapeados próximos a genes cujos produtos de expressãovêm sendo associados com a tolerância à dessecação das sementes. O QTL3, que estálocalizado no bin 8.05, apresenta-se próximo a três genes, o ncr(sod3c) que codifica parasuperóxido dismutase, o act1, que codifica para actina e o tub2, cujo produto gênico é umabeta tubulina (Maize Genetics and Genomics Database, 2005).Tanto os microtúbulos quanto os microfilamentos de actina compõem o citoesqueleto.São os principais componentes dos fusos mitóticos e meióticos, auxiliando o movimento doscromossomos durante a mitose e a meiose. A organização dos microtúbulos é sensível adiferentes fatores ambientais, incluindo elevadas temperaturas (Bajer et al., 1993). Em eixosembrionários desidratados, essa estrutura se torna desorganizada, tanto em sementestolerantes quanto intolerantes à dessecação. Nessas últimas, diferentemente das tolerantes, ocitoesqueleto não se torna novamente organizado com o processo de embebição da semente,causando, então, danos às sementes (Berjak & Pammenter, 2003).Além da região genômica onde está mapeado o QTL3, outro loco da superóxidodismutase, ncr(sod3a), encontra-se localizado no bin 6.05. Segundo as informaçõesencontradas no Maize Genetics and Genomics Database (2005), o produto gênico desse locoencontra-se localizado na mitocôndria. Injúrias na membrana mitocondrial e nas proteínasenvolvidas na cadeia transportadora de elétrons podem resultar na geração de radicais livres.Os radicais livres geralmente causam danos em ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos, tendocomo primeiro alvo as membranas, o que constitui uma das causas da perda da integridadedas mesmas em organismos sensíveis à dessecação quando estão sob condições de estressehídrico (Hoekstra, 2002; Mundree et al., 2002). Dessa forma, mecanismos antioxidantesconstituem parte da adaptação ao estresse térmico e vêm sendo fortemente correlacionadoscom a aquisição de termotolerância (Maestri et al., 2002).Os marcadores nc013 e umc2059, ligados aos QTLs 1 e 2 no cromossomo 6,encontram-se mapeados próximo aos locos que codificam a deidrina 1 (dhn1), proteína dechoque térmico (hsp101) e a proteína LEA do grupo 3 (mlg3), além da superóxido dismutase.Nieto-Soleto et al. (2002) mapearam o marcador umc132 ligado a uma proteína de choquetérmico em milho. Segundo os autores, a região desse marcador, que está localizado no bin6.07, está envolvida com a sensibilidade à seca e com a concentração de ABA tanto no xilemaquanto em folhas.LEA proteínas do grupo 3 e do grupo 2, que é conhecido como deidrina, sãoacumuladas quando há sinal de algum estresse, sendo associadas com a maturação e atolerância à dessecação de sementes (Yang et al., 1997; Baker et al., 1988; Thomann et al.1992).A proteína choque térmico Hsp101 foi encontrada por Kollipara et al. (2002) comdiferenças na expressão entre sementes de milho tolerantes e intolerantes à alta temperatura desecagem, sendo que a mesma se encontra entre os locos dos marcadores nc013 e umc2059,mapeados no presente trabalho. As proteínas Hsp, cuja expressão é induzida pelos mesmostipos de estresse que induzem a expressão de LEAs proteínas, têm sua síntese coincidentecom a aquisição da tolerância à dessecação (Hoekstra et al., 2001).A identificação desses QTLs certamente oferece  contribuição para o entendimento datolerância de sementes de milho a alta temperatura de secagem, podendo levar a identificaçãode genes e elucidação dos mecanismos envolvidos na expressão da tolerância. Considerandoque tantos os efeitos aditivos, dominantes e sobredominantes são importantes no controle datolerância à alta temperatura de secagem, a escolha de métodos de melhoramento queexplorem todas as fontes de variabilidade para essa característica em milho é de fundamentalimportância.BAJER, A.S.; SMIRNOVA, E.A.; MOLE-BAJER, J. Microtubule conventing centres -implications for microutubule dynamics in higher plants. Chromosome Segregation andAneuploidy, NATO ASI Series, v. H72, (ed. B. K. Vig), p.225-239. 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Mapeamento de QTLs associados com tolerância de sementes de milho à alta temperatura e secagem.

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