GUIMARAES, C. T.

IANI, F.

JARDIM, S. N.

MAGALHAES, J. V. de

PADILHA, L.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Marcadores Microssatélites Multiplex para Análise Genética de Milho e Seu Emprego paraEstudos de Diversidade e Proteção de CultivaresSílvia N. Jardim1, Lilian Padilha2; Felipe Iani3, Jurandir V. Magalhães4 e Claudia T. Guimarães51Pesquisadora, Embrapa Milho e Sorgo, CP. 151, CEP 35701-970, Sete Lagoas-MG,silvia@cnpms.embrapa.br; 2Embrapa Café, lilian.embrapa@uol.com.br; 3Embrapa Milho eSorgo; 4Embrapa Milho e Sorgo, claudia@cnpms.embrapa.br; 5Embrapa Milho e Sorgo,jurandir@cnpms.embrapa.br.Palavras-chave: Zea mays L., marcadores moleculares, multiplex, linhagem elite.A tecnologia de marcadores moleculares tem demonstrado ser uma ferramentaeficiente para a caracterização de recursos genéticos, e em programas de melhoramento tem sidoempregada de maneira crescente para o desenvolvimento de cultivares, avaliação de pureza desementes e proteção intelectual.Centenas de marcadores microssatélites já foram descritos em milho, inclusivecom sua localização cromossômica determinada. Estes vêm sendo empregados amplamente nofingerprinting de germoplasma de milho (Smith et al. 1997; Senior et al. 1998, Gethi et al., 2002;Liu et al., 2003) por causa do seu alto nível de polimorfismo (Saghai Maroof et al., 1994) e pelafacilidade de automação do sistema de detecção. Na Embrapa Milho e Sorgo o fingerprinting daslinhagens elite vem sendo desenvolvido para auxiliar o programa de melhoramento de milho naalocação das linhagens elite em grupos heteróticos e para a seleção de genitores em cruzamentos(Padilha, 2002).Atualmente, o programa de melhoramento de milho da Embrapa possui cerca de200 linhagens elite, com uma capacidade crescente de geração de novas. O fingerprinting de umagrande coleção como essa requer o emprego de métodos de larga escala no laboratório, e nacoleta e armazenagem dos dados gerados. O uso de conjuntos multiplex de marcadoresmicrossatélites fluorescentes aumenta enormemente a capacidade de realização de genotipagemsemi-automatizada de um grande número de amostras, permitindo a caracterização mais rápida derecursos genéticos, e com um menor dispêndio de reagentes. O objetivo deste trabalho foiotimizar um método multiplex semi-automatizado de detecção de marcadores microssatélites emmilho. Os conjuntos de reações multiplex otimizados permitirão a avaliação genotípica em largaescala das linhagens elite do programa de melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo.MetodologiaA partir de dados de microssatélites de 48 linhagens elite de milho, avaliadasanteriormente (Padilha, 2002), foram selecionados os 21 mais informativos entre os 100avaliados. Para essa seleção foram levados em consideração o seu polimorfismo, sua distribuiçãoao longo do genoma, pela freqüência bem distribuída entre os seus alelos e pelo valor doConteúdo de Informação do Polimorfismo (PIC).Esses 21 marcadores foram organizados de modo a formar sete tripletes (Tabela1). Tais conjuntos de tripletes foram testados em quatro linhagens elite de milho quanto àamplificação de fragmentos detectados satisfatoriamente pelo equipamento ABI377.Após vários ajustes foi estabelecido um protocolo de amplificação satisfatóriapara todos os conjuntos multiplex, que poderá ser empregado em qualquer DNA genômico demilho, descrito a seguir.  As reações de amplificação em multiplex foram preparadas com volumefinal de 20 µL, consistindo de 30 ng de DNA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5mM deMgCl2, 0,5U Taq DNA polimerase (Invitrogen, Carslbad, CA), 0,25 mM dNTPs e 2,5 pM decada um dos pares de iniciadores componentes da reação multiplex. As amplificações seguiram-se mediante as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por cinco minutos, 30 ciclos de95ºC por um minuto, 55ºC por dois minutos e 72ºC por dois minutos, elongação final a 72ºC porcinco minutos. A reação de amplificação foi diluída duas vezes em água destilada e 3 µL dessadiluição foram misturados a 0,3 µL do padrão GS-500 ROX (Applied Biosystems, Foster City,CA), 0,8  µL de formamida HI-DI (Applied Biosystems, Foster City, CA) e 0,4 µL de tampão decarregamento (blue dextran 50mg/ml; EDTA 25 mM). As amostras foram desnaturadas por doisminutos a 95°C e mantidas em gelo até o carregamento de 3 µL em gel de poliacrilamida 5%(p/v) (Long Ranger Gel Solution, Cambrex); uréia 6 M; Tris 100 mM; ácido bórico 100 mM eEDTA 2 mM. A eletroforese foi realizada no seqüenciador automático de DNA ABI Prism 377(Applied Biosystems, Foster City, CA), por 2,5 h a 3000V em tampão TBE (Tris-HCl 0,89M;ácido bórico 0,02M e EDTA 0,02M pH 8,0).Tabela 1: Conjuntos multiplexpadronizados para amplificação de microssatélites demilho.icrossatélite in luorescênciaultiplexupssr14 .09 ETmc1771 .04 EXnlg182 .03 -FAMhi053 .05 ETmc1862 .11 -FAMnlg1863 .03 EXhi084 0.04 ETmc1653 .07 EXnlg589 .10 -FAMhi116 .06 -FAMupssr24 .08 ETnlg1006 .00 EXnlg2241 .06 -FAMmc1019 .06 ETnlg161 .00 EXmc1084 0.07 ETmc1033 .02 -FAMnlg125 .02-2.03 EXmc1016 .02 -FAMnlg1338 .01 ETmc1008 .01 EXOs 21 locos SSR avaliados em milho foram polimórficos nas linhagensestudadas, amplificando um total de 370 alelos. O número de alelos por loco variou de oito(umc1771) a 36 (bnlg1006), indicando ampla diversidade genética entre os genótipos avaliados.Os valores de PIC para os 21 locos SSR de milho variaram de 0.65 (bnlg589) a 0.96 (bnlg1006)(Tabela 2).Estes conjuntos multiplex vão permitir um ganho de tempo e emprego de umnúmero menor de reagentes na análise por marcadores moleculares de genótipos de milho,facilitando o trabalho em larga escala na genotipagem de milho.Tabela 2: Características dos 21 locosSSR avaliados em linhagens de milho.SR Número deAlelosICnlg100636 ,96nlg12520 ,92nlg133820 ,88nlg16126 ,92nlg18216 ,88nlg186326 ,92nlg224114 ,86upssr1418 ,79upssr2429 ,94hi08417 ,88mc100825 ,92mc101626 ,93mc101916 ,90mc103326 ,95mc108413 ,68mc165325 ,92mc17718,68mc18629,68nlg58915 ,651hi053 1 ,82hi1168,75ConclusõesFoi descrito o desenvolvimento e otimização de um sistema eficiente multiplexpara análise de um conjunto selecionado de marcadores microssatélites hipervariáveis em milho.Foi otimizado um procedimento que permite a análise semi-automatizada de 21 marcadoresmicrossatélites distribuídos em sete reações de amplificação.A otimização destas reações em condições multiplex resulta não apenas naseleção de locos com alto grau de polimorfismo, mas também efetivamente permite o avanço davelocidade dos estudos de diversidade das linhagens elite do programa de melhoramento daEmbrapa Milho e Sorgo.Referências bibliográficasSAGHAI MAROOF, M.A.; BIYASHEV, R.M; YANG, C.P.; ZHANG, Q.;ALLARD, R.W. Extraordinarily polymorphic microssatellite DNA in barley: species diversity,chromosomal locations, and population dynamics. Proceedings National Academy of Science,v.91, p. 5466-5470, 1994.GETHI, J.G.; LABATE, J.A.; LAMKEY, K.R.; SMITH, M.E.; KRESOVICH,S. SSR variation in important U.S. maize inbred lines. Crop Science, v.42, p.951-957, 2002.LIU, K.; GOODMAN, M.; MUSE, S.; SMITH, J.S.; BUCKLER, E.;DOEBLEY, J. Genetic structure and diversity among maize inbred lines as inferred from DNAmicrosatellites. Genetics, v.165, p. 2117-2128, 2003.PADILHA, L. Marcadores moleculares semi-automatizados na caracterização edeterminação da diversidade genética entre linhagens de milho tropical. Tese (doutorado).Universidade Federal de Lavras, Lavras. 2002.SENIOR, M.L.; MURPHY, J.P. GOODMAN, M.M.; STUBER, C.W. Utility ofSSRs for determining genetic similarities and relationships in maize using na agarose gel system.Crop Science, v.38, p.1088-1098, 1998.SMITH, J.S.C; CHIN, E.C.L.; SHU, H.; SMITH, O.S.; WALL, S.J.; SENIOR,M.L. MITCHELL, S.E.; KRESOVICH, S. ZIEGLE, J. An evaluation of utility of SSR loci asmolecular markers in maize (Zea mays L.): comparisons with data from RFLPs and pedigree.Theoretical and Applied Genetics, v.95, p.163-173, 1997.

Marcadores microssatélites multiplex para análise genética de milho e seu emprego para estudos de diversidade e proteção de cultivares.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/491233/1/Marcadoresmicrossatelites.pdf

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