CARNEIRO, A.

CARNEIRO, N.

LANA, U. G.

PICOLI, E. A. de T.

VALICENTE, F. H.

VASCONCELOS, M. J. V. de

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

Caracterização, Distribuição e Clonagem de Genes Cry em Cepas de BacillusThuringiensis do Banco da EMBRAPA - CNPMSFernando Hercos Valiciente1*, Edgard Augusto de Toledo Picoli1, Maria José Villaça deVasconcelos1, Nilton Carneiro1, Andréia Carneiro1, Ubiraci G. Lana11 Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG - 35701-970. *Autor para correspondência:valicent@cnpms.embrapa.brPalavras chave: “crystal protein”, Bacillus thuringiensis, Spodoptera, clonagem, milhotransgênico,Insetos como Spodoptera frugiperda são responsáveis por perdassignificativas na produção de milho, sendo necessário o seu controle que é realizadoprincipalmente pelo uso de inseticidas químicos. O controle biológico e a obtenção de plantasgeneticamente modificadas contendo genes de resistência a estes insetos são alternativas aesta prática (Valicente e Barreto, 2003, Praça et al. 2004).O uso de Bacillus thuringiensis (Bt) tem se destacado no controle biológicode insetos. O Bt é uma bactéria gram-positiva de solo que produz grandes quantidades deproteínas na forma de cristais (δ-endotoxinas). Estas proteínas (Inseticidal Crystal Proteins –ICPs) são tóxicas a uma variedade de insetos entre as ordens Lepidoptera, Diptera, eColeóptera (Kumar et al. 1996, Schnepf et al. 1998).Com o advento da biotecnologia, é possível a introdução de genes cry(crystal protein) em plantas de milho, dando origem a uma planta geneticamente modificadaque apresentam resistência a insetos praga como S. frugiperda devido a expressão deproteínas Bt (Buntin et al., 2001; Fernandes et al. 2003). Considerando o número decepas/isolados mantidos nas coleções, o uso de técnicas moleculares pode contribuir para arápida caracterização e identificação de um grande número de isolados de B. thuringiensis.O presente trabalho foi realizado para a caracterização de cepas,pertencentes ao banco de Bt EMBRAPA-CNPMS e que apresentaram taxas de mortalidademaiores que 75% em bioensaios com S. frugiperda. Adicionalmente, estas informações foramutilizadas na seleção das cepas utilizadas na clonagem de genes cry1C e cry1F.A extração de DNA foi realizada com base no método proposto porBravo et al. (1998). Uma alçada de bactérias foi transferida para tubos eppendorf contendo100 µl de água destilada e autoclavada. Placas com culturas novas, crescidas por 12 a 16 h emestufa a 28oC, foram utilizadas para a retirada desta alçada. Os tubos foram mantidos a -80oCpor 10 a 15 min, e em seguida as amostras foram fervidas por 10 minutos. Os tubos foramcentrifugados por 5 min a 14.000 rpm, e o sobrenadante utilizado como amostra de DNA,sendo este sobrenadante utilizado em até 48 horas após a extração.A caracterização das cepas foi realizada com base em PCR utilizandoiniciadores específicos (Ceron et al. 1994, 1995) para os genes (cry1A, cry1B, cry1C, cry1D,cry1E, cry1F e cry1G) que codificam para as proteínas de interesse. Os componentes dareação, ajustada para um volume final de 20 µL, consistiram de 3 µl de solução de DNA, 20mM Tris-HCl (pH 8,4); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 1,25 U Taq DNA polimerase; 0,125 mMdNTPs e 20 ρmols de cada iniciador. A amplificação foi realizada em termociclador PTC-200(MJ Research Inc.), com as seguintes condições de amplificação: desnaturação inicial a 94oCpor 2 minutos, 30 ciclos de 95oC por 1 minuto, 50/53/57 oC por 1 minutos e 72oC por 1minuto, elongação final a 72oC por 10 minutos, mantendo a reação à 4oC. A temperatura deanelamento dos iniciadores variou de 50 a 57 oC dependendo dos pares de utilizados.Foram avaliadas 166 cepas, onde o gene cry1D foi o mais freqüente(58,1%), ao passo que cry1C e cry1F foram os menos freqüentes nas cepas (1,8%) (Tabela 1).Contrariamente ao presente trabalho, cry1Ac foi o gene mais abundante encontrado por Gao etal. (2008) presente em 14,7% dos isolados avaliados por estes autores. Os genes cry1B ecry1E apresentaram freqüências intermediárias de 13,8 e 14,4%, respectivamente. Dentre ascepas avaliadas, 33 não amplificaram os fragmentos esperados, 103 amplificaram bandascorrespondentes a presença de apenas um gene, enquanto 26, 3 e 1 apresentaram um perfilesperado para dois, três e quatro genes, respectivamente (Tabela 2). Os genes cry1B e cry1Eforam, em geral, localizados em uma mesma cepa (Tabela 2). Vale evidenciar que de 41 cepasque apresentaram 100% de mortalidade em S. frugiperda, 21 apresentaram um perfilcorrespondente a presença de mais de um gene cry1, 11, 3, 1, 1 e 4 cepas apresentaramsomente o gene cry1D, cry1B, cry1C, cry1E, e nenhum dos genes avaliados, respectivamente(dados não apresentados).Tabela 1 - Caracterização das cepas de B. thuringiensis quanto a presençade genes cry. P – presença do fragmento de tamanho esperado, A – ausência do fragmentoesperado, BI – presença de bandas inespecíficas, FG – freqüência (percentagem) de cepasapresentando o gene (fragmento do gene), FBI – freqüência (percentagem) de cepasapresentando uma ou mais bandas inespecíficas.rimers j 01 e cj 02 j 04 e cj 05 j 06 e cj 07 j 08 e cj 09 j 10 e cj 11 j 12 e cj 13 j 14 e cj 15 j 16 e cj 17 j 18 e cj 19enesry1Aa/cry1Adry1Ab/cryIAc ry1Ac ry1B ry1C ry1Dry1Ea/cry1Ebry1Fa/cry1Fb ry1G.0 .0 .0 3.0 .0 7.0 4.0 .0 1.048.0 59.0 59.0 38.0 9.0 8.0 42.0 63.0 07.0I 6.0 .0 .0 .0 4.0 .0 .0 .0 8.0G .2 .2 .0 3.8 .8 8.1 4.4 .8 .6BI .6 .0 .2 .0 0.6 .6 .0 .0 8.9Tabela 2 – Distribuição dos genes cry1 amplificados por iniciadoresespecíficos, presentes nas cepas de B. thuringiensis utilizadas que apresentaram mais de 75%de mortalidade nos bioensaios com S. frugiperda.Iniciativas semelhantes de caracterização de coleções de B thuringiensisforam realizadas com sucesso na obtenção de informações papel de Bt no ambiente e dadistribuição dos genes cry entre os isolados (Bravo et al. 1998, Uribe et al. 2003, Gao et al.2008). Gao et al. (2008) obtiveram freqüências que variaram de 0,4 a 14,7% de cepas de Btapresentando genes cry1Ac e combinações de outros genes cry1, contudo de um total de 570isolados, 46,5% não apresentaram produtos de amplificação para nenhum dos genes cryavaliados. Uribe et al. (2003) encontraram 17,8% de isolados de Bt oriundos da Colômbia quetambém não amplificaram fragmentos correspondentes aos genes cry, enquanto os perfisobservados variaram de 1 a mais de cinco genes cry com freqüências que variaram de 11,67 a0,56% entre as cepas avaliadas. Interessante foi que a maior freqüência foi observada paracepas contendo os genes cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac e cry1B (Uribe et al. 2003).   Com base nas seqüências disponíveis no banco de dados National Center forBiotechnology Information (NCBI), novos iniciadores foram sintetizados no intuito de seclonar genes cry1C e cry1F, a serem utilizados na transformação genética de milho. Odesenho dos iniciadores foi realizado observando seqüências conservadas no alinhamento dosgenes próximas ao início (ATG) e ao final dos genes (TAG ou TAA). Adicionalmente, umsítio de restrição da enzima Bam HI foi adicionado à extremidade 5’ dos iniciadores. Osciclos do programa para a amplificação do gene foram alterados para as seguintes etapas:desnaturação a 94oC por 45 segundos, anelamento a 52oC por 45 segundos, e extensão a 72oCpor 4 minutos. Para as reações visando a clonagem dos genes foi utilizada a enzima PlatinumTaq DNA polymerase High Fidelity (Invitrogen).As bandas amplificadas que estavam de acordo com o tamanho esperado(aproximadamente 3.500 pb) foram purificadas do gel com o kit “QIAquick Gel Extractionperfil número de cepas perfis dos genes cry %1 33 nenhum gene 19,882 1 cry1Aa/cry1Ad 0,603 4 cry1B 2,414 1 cry1C 0,605 90 cry1D 54,226 2 cry1Ea/cry1Eb 1,207 1 cry1Fa/Cry1Fb 0,608 4 cry1G 2,419 1 cry1Ab/cry1Ac e cry1Fa/Cry1Fb 0,6010 2 cry1Ab/cry1Ac e cry1Ea/cry1Eb 1,2011 2 cry1Ab/cry1Ac e cry1G 1,2012 1 cry1B e cry1G 0,6013 1 cry1C e cry1D 0,6014 13 cry1Bb e cry 1Ea/cry1Eb 7,8315 5 cry1D e cry1Ea/cry1Eb 3,0116 1 cry1Fa/Cry1Fb e cry1G 0,6017 1 cry1Ab/cry1Ac, cry1B e cry1G 0,6018 1 cry1Aa/cry1Ad, cry1B e cry1G 0,6019 1 cry1B, cry1Ea/cry1Eb e cry1G 0,6020 1 cry1Ab/cry1Ac, cry1B, cry1C e cry1D 0,60total 166 100,00Kit“ (Qiagen, Valencia, CA) e seqüenciados com kit “Big Dye Terminator v3.1” (AppliedBiosystems, Foster City, CA, USA), clonadas em vetor (TOPO TA Cloning® pCR 2.1) etransformadas em células competentes. Foram obtidas colônias contendo clones dos genescry1F, cry1Ca e cry1Cb, para duas das cepas utilizadas. O plasmídeo contendo o fragmentocorrespondente aos genes cry foi extraído, e as amostras de DNA submetidas asequenciamento no seqüenciador ABI3100 (Applied Biosystems). A qualidade das seqüênciasavaliada pelo programa Seqman 3.57 (DNAstar, Madison, WI) e as seqüências analisadascom o programa BLAST – Basic Local Alignment Search Tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), selecionando o programa nucleotide blast, ealinhadas pelo programa ClustalW.O seqüênciamento das extremidades 5’ e 3’, e a tradução dos fragmentosobtidos, permitiram a confirmação da identidade dos genes (Figuras 1 e 2). Algumas dasseqüências amplificadas com os iniciadores para a clonagem do gene inteiro, obtidas a partirde cepas que apresentaram bandas inespecíficas na caracterização (Figura 3), tambémamplificaram fragmentos de tamanho esperado para os genes cry1C (Figura 4) e cry1F, eapresentaram similaridade com outros genes cry1. Isto sugere a possibilidade da presença deoutros genes similares com tamanhos diferentes, ou a condições de temperatura que tenhampermitido um pareamento parcial dos inciadores e amplificação dos fragmentos.Figura 1 – Comparação da seqüência 5’ da banda amplificada com osiniciadores desenhados com base nas seqüências próximas ao início do gene (ATG) para ogene cry1F, cepa 3926, utilizando o programa Nucleotide Blast.Outros possíveis genes cry1Ca foram amplificados para a cepa 1644, ecry1Ca para as cepas BTX e 3926, porém, não foi obtido sucesso na clonagem destes genese/ou na transformação em células competentes. As reações realizadas para amplificar o geneinteiro com as cepas que apresentaram 100% de mortalidade das lagartas, porém, que nãoamplificaram o fragmento esperado para os respectivos genes, também não amplificaram ofragmento correspondente aos genes cry1C e cry1F.O início dos genes foi clonado corretamente conforme exemplificado para ogene cry1F e cry1C, contudo, apesar das seqüências serem similares aos genes disponíveis nobanco de dados, o alinhamento nos permitiu verificar a falta de uma porção da extemidade 5’para os genes clonados. Ainda assim, o alinhamento da seqüência consenso com os genesdisponíveis, comparação com as informações do banco de dados (Figura 1) e a traduçãodestas seqüências (Figura 2) nos sugerem que as seqüências clonadas se tratam dos genescry1C e cry1F de interesse.A clonagem dos genes cry a partir de outras cepas de Bt, o sequenciamentodas seqüências obtidas, e a construção dos vetores de expressão estão em andamento visandoa obtenção de genes, ou fragmentos destes, a serem utilizados na transformação genética demilho.Figura 2 – Tradução do fragmento consenso 5’ do gene cry1C (oriundo da cepa 1644) ecomparação com o banco de dados.Figura 3 – Gel de agarose apresentando o padrão eletroforético diferentes cepas de B.thuringiensis (cepas numeradas de 1 a 23 correspondem respectivamente às cepas 1644, 1944,1945, 1946, 1948, 1953, 1954, 1956, 1974, 1980, 2051, 2052, 2054, 2060, 2884, 2885, 2886,2887, 2902, 2915, 2952, 3307, e 3743) em reações visando amplificar um fragmento do genecry1C. 50 bp – marcador de peso molecular 50bp DNA ladder. Observar o controle positivocom um fragmento com 130 pb e outros fragmentos inespecíficos amplificados.50bp 1     2     3     4    5     6     7     8    9    10   11  12   13  14   15   16   17   18  19   20   21   22  23 50bp350 pb130 pbFigura 4 – Gel de agarose apresentando a amplificação do gene cry1Ca em reaçõcry1CaFmanual e cry1CaR manual utilizando Platinum Taq DNA polimerase High Fidelity para ascepas que apresentaram amplificações inespecíficas para o gene cry1C (1745, 1756, 1825 e1924). 1Kb – marcador de peso molecular.Referências bibliográficasBRAVO, A.; SARABIA, S.; LOPEZ, L.; ONTIVIEROS, H.; ABARCA, C.; ORTIZ, A.; LINA, L.;VILLALOBOS, F. J.; PEÑA, G.; NUÑES-VALDEZ, M-E.; SOBERÓN, M. e QUINTERO, R.Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Applied andEnvironmental Microbiology, v. 64, p. 4965-4972, 1998.BUNTIN, G. D.; LEE, D.; WILSON, D. M. e MCPHERSON, R. M. 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Caracterização, distribuição e clonagem de genes Cry em cepas de Bacillus thuringiensis do banco da Embrapa-CNPMS.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/491228/1/Caracterizacaodistribuicao.pdf

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