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  Previous issue date: 2007-03-2

GIORDANO, L. de B.

INUOE-NAGATA, A. K.

NAGATA, T.

RIBEIRO, S. da G.

SANTANA, F. M.

ÁVILA, A. C. de

RCAAP - Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal

Detecção de um begomovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativas.

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

269Detecção de um bergamovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativas.Ciência Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.Ciência Rural, Santa Maria, v.37, n.1, p.269-272, j n-fev, 2007ISSN 0103-8478Detecção de um begomovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativasFlávio Martins SantanaI   Alice Kazuko Inoue-NagataII   Tatsuya NagataIIISimone da Graça RibeiroIV   Antônio Carlos de ÁvilaVLeonardo de Britto GiordanoVIDetection of a begomovirus in tomato leaf samples using non-radioactive probesRESUMOO aumento na ocorrência de begomoviroses(geminiviroses) em tomateiros, Lycopersicon esculentum Mill.,em várias regiões brasileiras, vem causando grandes prejuízospara o agronegócio de tomate, devido à ocorrência do insetovetor, Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotipo B). Adiagnose é realizada em geral por “polymerase chain reaction”(PCR) ou por hibridização com sondas radioativas. A PCR éum método de alta sensibilidade, porém apresenta adesvantagem da possibilidade de obtenção de resultados falso-positivos, devido a contaminações, ou falso-negativos causadospor inibidores contaminantes da reação, ou pela extremaespecificidade dos iniciadores. A hibridização de ácidosnucléicos com sondas radioativas tem o seu uso limitado devidoà necessidade de infra-estrutura especial, treinamento depessoal, riscos para a saúde do manipulador e demandaconstante de radioquímicos. O presente trabalho tem porfinalidade demonstrar a viabilidade do uso do método dehibridização com sondas não-radioativas para a detecção deum begomovírus de tomateiro do Brasil. A sensibilidade doteste foi alta, obtendo-se detecção de até 0,1fg do DNAhomólogo e em extrato bruto foliar diluído até 100 vezes.Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, geminivírus,diagnose, digoxigenina.ABSTRACTMajor outbreaks of tomato begomoviruses(geminiviruses) in several tomato Lycopersicon esculentumMill growing in many parts of Brazil have been imposingsignificant losses upon the tomato agribusiness, due to theintroduction of the Bemisia argentifolii (Bemisia tabaci biotypeB). Polymerase chain reaction (PCR) and hybridization aregenerally used for diagnosis. The PCR is a detection methodwith high sensitivity, however it has the disadvantage ofproducing false-positives, due to contamination, or false-negatives caused by inhibitors or because of the high primerspecifity. The use of nucleic acid hybridization with radio-labelled probes is restricted due to the requirement of specialinfrastructure and handling experience, the risk for the user’shealth and a regular radiochemical element supply. This studyis aimed at demonstrating the usefulness of the hybridizationmethod with non-radioactive probes for detection of a tomatobegomoviruses in Brazil. The sensitivity of this method washigh enabling the detection of 0.1fg of homologous DNA andin crude sap extract diluted up to 100-fold.Key words: Lycopersicon esculentum, geminivirus, diagnosis,digoxigenin.O tomateiro, Lycopersicon esculentumMill., é uma das hortaliças de maior importância noBrasil, tanto para consumo in natura como para o setoragroindustrial. Um dos principais problemas na cadeiade produção de tomate reside na alta incidência devírus da família Geminiviridae, gênero Begomovírus,constituídos de DNA de fita simples e circular. A- NOTA -IPrograma de Pós-graduação em Fitossanidade, Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Embrapa Clima Temperado, CP. 403,96001-970, Pelotas, RS, Brasil. E-mail:  fsantana@cpact.embrapa.br. Autor para correspondência.IILaboratório de Biologia Molecular da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil.IIICurso de Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, DF, Brasil.IVLaboratório de Biologia Molecular da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil.VLaboratório de Virologia da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil.VILaboratório de Melhoramento Vegetal da Embrapa Hortaliças, Brasília, DF, Brasil.Recebido para publicação 05.10.05   Aprovado em 26.07.06270                                                                Santana  et al.Ciência Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.ocorrência da doença tem sido generalizada desde oNordeste ao Sudeste brasileiro, além de demais paísessul-americanos, onde perdas de 40% até 100% daprodução têm sido relatadas. Os sintomas da doençasão amarelecimento de nervuras, rugosidade,diminuição do tamanho das folhas, clorose internervale mosaico dourado (TAVARES 2002; RIBEIRO et al.,2003). A transmissão desse vírus se dá pela mosca-branca, Bemisia argentifolii Bellows & Perring(SANTOS et al., 2004). A diagnose é, em geral, realizadapela avaliação dos sintomas e por meio de testes dedetecção por “polymerase chain reaction” (PCR) e porhibridização com sonda radioativa (SANTANA et al.,2001; NAGATA et al., 2004). Os métodos de hibridizaçãocom sonda não-radioativa já vêm sendo utilizados paradetecção de begomovírus fora do Brasil (SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 1999). Este trabalho teve como objetivoavaliar o uso do método de detecção por hibridizaçãocom sonda marcada com digoxigenina aplicado a umisolado de begomovírus em tomateiro no Brasil.A sonda não-radioativa foi preparada como clone contendo o gene completo da capa protéica(pCP) do isolado DF-BR2 de tomate, presente noDistrito Federal, uma  possível variante do begomovírusTomato rugose mosaic vírus - TRMV (INOUE-NAGATA et al., 1999,). A síntese da sonda foi feitautilizando-se o DIG-High prime labeling kit (Roche)seguindo-se as recomendações do fabricante, usando3μg do DNA amplificado do clone pCP por PCR com osoligonucleotídeos CP1 e CP2 (fragmento de 0,9kb),contendo todo o gene da capa protéica (NAGATA etal., 2004).A hibridização foi realizada em membranasde náilon (Hybond N+, Amersham Biosciences) com aaplicação de plasmídeos ou de extratos de plantasdiluídos em 0,4N NaOH. Após a aplicação, a membranafoi neutralizada com Tris 0,5 M pH 7,5 por cincominutos, secada a temperatura ambiente e armazenadaa 4°C. Um total de 25ng.ml-1 da sonda marcada comdigoxigenina foi utilizada para a hibridização conformea recomendação do fabricante. A hibridização foirealizada a 68°C, usando-se o tampão de hibridizaçãopadrão (5x SSC, N-lauroylsarcosine 0,1%, SDS 0,02%,reagente bloqueador 1% (Roche)) e as lavagens foramrealizadas a 68°C, duas vezes com 2x SSC, SDS 0,1%por cinco minutos e duas vezes com 0.5x SSC, SDS0,1% por 15 minutos.As membranas foram então bloqueadas poruma hora a temperatura ambiente ou por toda a noite a10°C em tampão maléico (ácido maléico 100mM, NaCl150mM pH 7,5) com reagente bloqueador a 1% (reagentebloqueador - Roche). À solução bloqueadora, foiacrescentado anticorpo antidigoxigenina conjugadocom fosfatase alcalina (AP-alkaline phosphatase,150mU.ml-1) e incubado por uma hora a temperaturaambiente ou por toda a noite a 10°C. Três lavagensforam realizadas com tampão maléico acrescido de 0,3%de tween-20 por 15 minutos e a revelação foi feita coma adição de NBT (nitro blue tetrazolium) e BCIP (5-bromo-4-chloro-3 indolyl phosphate) em tampão derevelação (Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl2 50mM,pH 9,5).Um processo alternativo de revelação porquimioluminescência foi avaliado. O bloqueamento foifeito por uma hora a temperatura ambiente ou por todaa noite a 10°C em tampão fosfato salino (PBS) comreagente bloqueador a 1%. À solução bloqueadora, foiacrescentado anticorpo antidigoxigenina conjugadocom peroxidase (HRP-horseraddish peroxidase,75mU.ml-1), sendo incubado por uma hora a temperaturaambiente ou por toda a noite a 10°C. Três lavagensforam realizadas com PBS – Tween-20 (0,05%) por 15minutos. A revelação foi feita com a adição de substratoquimioluminescente (ECL detection kit, Amersham),conforme as recomendações do fabricante. O excessoda solução contendo substrato foi removido e asmembranas foram expostas ao filme de raios-X (KodakX-OMAT) por cinco minutos (curta exposição) ou portoda a noite (longa exposição).Para se verificar a possibilidade de utilizaçãodeste método em testes de rotina, foram avaliadasfolhas de tomateiro coletadas no campo. Foramavaliados, por colorimetria e quimioluminescência,folhas com sintomas e sem sintomas de begomovírus.O DNA homólogo ao do TRMV, DF-BR2 foiaplicado na membrana em várias concentrações parase avaliar a sensibilidade do método de detecção(Figura 1A). De 1ng a 0,1fg de DNA purificadohomólogo aplicado nas membranas, a reação foiobservada em todas as concentrações. O resultado foisemelhante tanto por colorimetria (Dig-AP) como porquimioluminescência (Dig-HRP1), demonstrando a altasensibilidade do teste. Uma exposição mais longa damembrana ao filme de raios-X permitiu uma maior nitidezda reação (Dig-HRP2). O controle negativo utilizado,DNA purificado de bacteriófago lambda, nãoapresentou qualquer reação com a sonda (Figura 1A),demonstrando a especificidade do teste.Extratos de folhas de tomate infectadas como isolado DF-BR2 ou plantas sadias foram aplicadosem membranas de náilon nas diluições 10-1 a 10-4. Asmembranas foram hibridizadas e a reação positiva foiobservada nas diluições 10-1 e 10-2, tanto porcolorimetria (Dig-AP), como por quimioluminescência(Dig-HRP) (Figura 1B). Não foi observada reação dasonda com o extrato de planta sadia, o que mostra que,271Detecção de um bergamovírus em amostras foliares de tomateiro com sondas não-radioativas.Ciência Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.Figura 1 - Hibridização com sonda marcada com digoxigenina. A: Teste com DNA homólogo para se determinar a sensibilidade eespecificidade do teste. Aplicadas diluições de 1 ng a 0,1fg do DNA homólogo (+) nas colunas “a” e DNA de bacteriófagolambda (-) nas colunas “b”. B: Teste com diluições de 10-1 a 10-4 do extrato de plantas infectadas (+) nas colunas “a” e sadias(-) nas colunas “b”; C: Teste com amostras coletadas no campo. Folhas com sintomas típicos de geminivírus (1a, 2a, 3a, 4a,1b e 2b) ou sem sintomas (3b, 4b, 1c e 2c) foram avaliadas. Planta infectada (3c) e sadia (4c) utilizadas como controles.Detecção por colorimetria (Dig-AP), quimioluminescência curta (Dig-HRP1) ou longa (Dig-HRP2) exposição ao filme deraios-X.272                                                                Santana  et al.Ciência Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.por este método, pode-se detectar plantas infectadasem diluições de dez a 100 vezes.Das folhas provenientes do campo (Figura1C), com sintomas (1a, 2a, 3a, 4a, 1b e 2b) ou sem sintomas(3b, 4b, 1c e 2c), os resultados por colorimetria (Dig-AP) e quimioluminescência (Dig-HRP1, Dig-HRP2)foram os mesmos. As plantas com sintomas debegomovírus reagiram positivamente com a sondaespecífica. Das quatro plantas sem sintomas, umamostrou reação positiva no teste (1c), indicando que ométodo pode identificar plantas infectadas, mesmo queessas não apresentem sintomas aparentes. O controlepositivo (3c) mostrou reação similar às demais plantasinfectadas e o controle negativo (4c) não reagiu com asonda, conforme esperado.A hibridização com sondas radioativas é ummétodo altamente específico e de amplo uso emdetecção, porém esbarra na necessidade de uma infra-estrutura adequada, de treinamento de pessoal e noaumento de riscos para a saúde dos usuários. Comoalternativa à hibridização por sondas radioativas,surgiram os reagentes para a confecção de sonda não-radioativa, com o uso de digoxigenina, biotina etc.O método avaliado neste trabalho utilizousondas marcadas com digoxigenina, que mostrarameficiência e praticidade. A sensibilidade foi bastantealta, chegando à escala de fentogramas, quandohibridizado com DNA homólogo. A grande vantagemdeste método é a longevidade da sonda, que pode serusada por várias vezes e por pelo menos um ano, sem aperda da atividade, segundo informações do fabricante.O método vem sendo empregado rotineiramente naEmbrapa Hortaliças para detecção de DF-BR2, com umamodificação em relação ao método descrito: o protocolode detecção utilizado para anticorpo conjugado comfosfatase alcalina está sendo realizado com o tampãoPBS-T. Esta modificação foi feita devido à baixalongevidade do tampão maléico, que apresentacrescimento microbiano com muita facilidade, mesmoapós autoclavagem.O método de hibridação com sonda não-radioativa viabiliza a detecção de um begomovírus emtomateiro, em um grande número de amostras, de modoeficiente e sensível. Comparando-se os níveis dedetecção pela sonda com o DNA purificado e comextrato da planta infectada, poder-se-ia inferir que, comeste método, é possível diagnosticar plantas infectadascom DF-BR2 até a escala de fentogramas, o que, paraeste trabalho, correspondeu a uma diluição do extratoda planta infectada em até 100 vezes. Para confirmaçãodesses valores, poder-se-ia realizar a quantificação dovírus na planta por PCR em tempo real.REFERÊNCIASINOUE-NAGATA, A.K. et al.  Expression of the coat proteinof tomato infecting geminivirus in Escherichia coli forserological studies.  Virus Reviews & Research, v.4, p.1511999.  (Resumo).NAGATA, T. et al.  Print-capture PCR for detection of tomatogeminiviruses from plants and whiteflies.  FitopatologiaBrasileira, v.29, p.91-93, 2004.RIBEIRO, S.G. et al.  Distribution and genetic diversity oftomato-Infecting begomoviruses in Brazil.  Archives ofVirology, v.148, p.281-295, 2003.SÁNCHEZ-CAMPOS, S., et al.  Displacement of tomato yellowleaf curl virus (TYLCV)-Sr by TYLCV-Is in tomato epidemicsin Spain.  Phytopathology, v.89, p.1038-1043, 1999.SANTANA, F.M. et al.  Sources of resistance in Lycopersiconspp. to a bipartite whitefly-transmitted geminivirus from Brazil.Euphytica, v.122, p.45-51, 2001.SANTOS, C.D.G. et al.  Espécies vegetais hospedeiras debegomovírus isolados de tomateiro em Goiás e no DistritoFederal.  Fitopatologia Brasileira, v.29, p.450-455, 2004.TAVARES, C.A.M.  Perspectivas econômicas da tomaticulturafrente aos problemas causados pelo geminivírus.  Biológico,v.64, p.157-158, 2002.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/779899/1/santanadetec.pdf

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