CARNEIRO, N. P.

CARVALHO, L. J. C. B.

DURAES, F. O. M.

LIMA, T. R.

MARRIEL, I. E.

PARENTONI, S. N.

PINTO, A. C.

PURCINO, A. A. C.

SOUZA, I. R. P. de

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 Padrões eletroforeticos da família multigênica da glutamina sintetase em genótipos de milhocontrastantes em eficiência de uso de nitrogênioAntonio A. C. Purcino (1*), Thales R. Lima (2), Ane C. Pinto (1), Isabel R. P. de Souza (1), IvanildoE. Marriel (1), Sidney N. Parentoni (1), Frederico O.M. Durães (1) e Luís J.C.B. Carvalho(2)(1)Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, CEP 35.701-970, Sete Lagoas, MG,(*)corsetti@cnpms.embrapa.br, (2)Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, CP 02372, CEP70.770-900, Brasília, DF.IntroduçãoEm plantas, a glutamina sintetase é codificada por uma família multigênica cuja expressão éregulada por múltiplos promotores e por estímulos ambientais de maneira especifica a órgãos etecidos (Miflin e Habash, 2002). Em milho, as isoproteínas da glutamina sintetase (GS, EC6.3.1.2) podem ser separadas em colunas de DEAE-celulose em dois picos correspondentes asisoformas citossólica (GS1) e cloroplástica (GS2). A isoforma GS2 é codificada por um únicogene, mas a isoforma GS1 é codificada por 5 genes (GS1-1, GS1-2, GS1-3 , GS1-4 e GS1-5), sendoque o GS1-5 é bastante difícil de ser identificado  por hibridação de RNA (Sukanya et al., 1994).Ao nível de transcrito, esses genes mostram resposta diferencial ao amônio e ao nitrato. Nomesófilo foliar e nas celulas das raízes, a GS2 é responsiva ao nitrato mas não a amônia e,portanto, nas raízes a GS2 pode ser detectada somente em plantas tratadas com nitrato(Sakakibara et al., 1992). Em raízes de plântulas de milho cultivadas em nitrato por 6 dias, o GS1-1, GS1-3 e o GS1-4 são mais expressos que o GS1-2, enquanto na parte aérea, o GS1-3 e  GS1-4 sãomais expressos que o GS1-1 e o GS1-2 (Sukanya et al., 1994). O objetivo desse trabalho foi avaliaro padrão de expressão das isoenzimas da GS em linhagens e híbridos simples de milhoselecionados para alta e baixa eficiência de uso de nitrogênio (EUN). Mais especificamente,avaliou-se nesse trabalho a hipótese de que plantas com alta e baixa EUN mostram padrõesdiferenciais de expressão das isoenzimas da GS em resposta à nutrição com nitrato. Utilizou-senesse estudo linhagens e híbridos simples, porque em culturas de polinização cruzada como omilho, a avaliação de linhagens “per se” permite a identificação de mecanismos de EUNcontrolados por genes de efeito aditivo, enquanto híbridos simples permitem a identificação demecanismos controlados por efeitos aditivos e não aditivos (Hallauer e Miranda Filho, 1998)Materiais e MétodosCultivos das plantas em casa de vegetação: 5 plantas de genótipos com alta e baixa EUN listadosna Tabela 1 foram cultivadas em vasos com 1 kg de vermiculita e fertilizados em dias alternadoscom 200 mL de uma solução de Hoagland  preparada para fornecer um nível baixo (0,8 ou 1,6mM) ou alto (16 mM) de nitrato. Cada combinação nitrogênio x genótipo foi repetida 3 vezes equando as plantas atingiram 4 folhas, as raízes e folhas foram colhidas e mantidas a –80o  C até arealização das análises.Separação da isoenzimas da GS por PAGE nativa e coloração para atividade transferase: paravisualização do polimorfismo das isoenzimas da GS, 15 µg de proteína solúvel total foramseparadas por eletroforese PAGE nativa, em géis de 8%, a 200V, por 90 min e 4oC. Avisualização das bandas foi obtida pelo  desenvolvimento de cor para a atividade transferasecomo descrito por Brune et al. (1998). Em um experimento adicional, o polimorfismo da GS demilho e tabaco foi comparado em um mesmo gel para identificação da banda de GS2, já queplantas jovens de tabaco não possuem a banda GS1.Separação das isoenzimas da GS por PAGE seguida de Western blot: após a eletroforese emPAGE nativa como descrito acima, as isoenzimas da GS foram transferidas para filtros de PVDF,sondadas com anticorpos contra GS1 e GS2 conforme descrito por Purcino et al. (1998) efotografadas.Eletroeluição das bandas de PAGE, separação por SDS-PAGE seguida de Western blot: asisoenzimas da GS de folhas do HS 723 x 64 cultivado sob alto e baixo nitrato foram separadaspor eletroforese PAGE preparativa como descrito acima. Depois da eletroforese, cada gel foicortado em segmentos de 1 cm de largura e 1 segmento de cada gel foi colorido para atividadetransferase para ser utilizado como marcador da localização das bandas nos géis que não foramcoloridos. A porção de cada gel correspondente a essas bandas foi individualmente cortada, oconteúdo das proteínas foi eletroeluido, passou por uma nova separação por SDS-PAGE e aseguir sondado com os anticorpos contra GS1 e GS2.Resultados e DiscussãoO polimorfismo para as bandas de GS separadas por PAGE nativa e visualizadas para atividadetransferase nos genótipos de milho cultivados sob dois níveis de nitrato, aparece na Figura 1 paraa analise de folhas e na Figura 2 para a analise das raízes. Os resultados obtidos mostraram queem géis nativos a GS de folhas pode ser separada em uma banda “superior” mais bem definida euma “inferior” mais difusa. De maneira geral, a expressão dessas bandas não mostrou um padrãoclaro para o efeito do nitrato, capaz de diferenciar genótipos com baixa e alta EUN. Em raízes abanda “superior” foi mais expressa que a banda “inferior” e, aparentemente, favorecida pelanutrição com nitrato. Para identificar qual dessas bandas correspondiam à isoformas GS1 e GS2,a posição da banda GS2 do milho foi comparada com a posição da banda GS2 de tabaco, umaplanta cujas folhas jovens não apresenta a isoforma GS1 (Figura 3). Os resultados da Figura 3sugerem, portanto,  que a banda “superior” observada nas folhas do milho tinham uma densidadede carga correspondente a isoforma unigênica GS2, e que a banda “inferior” corresponderia aisoforma multigênica GS1. Entretanto, a Figura 2 mostra que a banda “superior” das raízes foimais expressa que a banda “inferior” e, como em raízes de milho a isoforma citossólica é maisexpressa que a isoforma plástidica GS (Sakakibara et al., 1992), esses resultados não indicam demaneira inequívoca que a banda “superior” seja a isoforma GS2 e que a banda “inferior” seja aisoforma GS1. Visando responder essa duvida, os produtos da família multigênica da GS foramseparados em géis de PAGE, transferidos para membranas de PVDF e sondados com osanticorpos contra GS1 e GS2 (Figura 4). Nas folhas, os resultados obtidos indicaram que oproduto do gene GS2 estava presente tanto na banda “superior” quanto na banda “inferior”, masnas raízes o sinal estava mais visível na banda “superior” que na banda “inferior”. A eletroeluiçãodas bandas “superior” e “inferior”, seguida de analise por SDS-PAGE e sondagem com osanticorpos contra GS1 e GS2 (Figura 5) confirmaram que essas duas bandas contêm epitoposreconhecidos por esses dois anticorpos. Em conjunto, esses resultados sugerem que tanto a banda“superior” quanto a banda “inferior” observadas nos géis de PAGE nativo são uma mistura deprodutos dos genes da GS, e elas não podem ser consideradas como indicativos da expressão dasisoformas cloroplástica GS2 e citossólica GS1. É  possível que a presença desses dois peptídeosnas duas bandas da eletroforese PAGE seja resultado da fosforilação parcial e da interação da GScom a proteína 14-3-3 (Lima et al., 2005), o que pode modificar o padrão de migração daholoenzima GS. Observou-se que a expressão das bandas de GS em PAGE foi influenciada pelanutrição com nitrato, sem haver entretanto, uma correlação com a classificação da EUN dosgenótipos testados.Literatura citada     Brune, W., A.C. Alfenas, T.G. Jughans. Identificações especificas de enzimas em géis. p. 201-328 In A.C. Alfenas (ed.) Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins. Editora UFV, Viçosa;1998    Hallauer, A.R., Miranda Filho,J.B. Quantitative Genetics in maize breeding. Iowa UniversityPress-Ames, 1988. 468 pp.    Lima, L., A. Seabra, P. Melo, J. Cullimore, H. Carvalho. Phosphorylation and subsequentinteraction with 14-3-3 proteins regulate plastid glutamine synthetase in Medicago truncataPlanta 2005; 223(3):558-567    Miflin B.J., D. Habash. The role of glutamine synthetase and glutamate  dehydrogenase innitrogen assimilation and possibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops. J.Exp. Bot. 2002; 53(370): 979-987    Purcino, A.A.C., C. Arellano, G.S. Athwal, S.C. Huber. Nitrate effect on carbon and nitrogenassimilating enzymes of maize hybrids representing seven eras of breeding. Maydica 1998; 43:83-94    Sakakibara, H., S. Kawabata, H. Takahashi, T. Hase, T. Sugiyama. Molecular cloning of thefamily of glutamine synthetase genes: expression of genes for glutamine synthetase andferredoxin-dependent glutamate synthetase in photosynthetic and non-photosynthetic tissues.Plant Cell Physiol. 1992; 33(1): 49-58    Sukanya R., M.G. Li, D.P. Snustad. Root- and shoot-specific responses of individual glutaminesynthetase genes of maize to nitrate and ammonium. Plant Mol Biol 1994; 26(6): 1935-1946.Tabela 1 – Genótipos de milho contrastantes para eficiência de uso de nitrogênio usados nesseestudoGenótipo Natureza Genética EUNCMS 28-7.1 Linhagem AltaCMS 28-8.1 Linhagem AltaHS 724 x 22 Híbrido simples AltaHS 724 x 64 Híbrido simples AltaHS 723 x 64 Híbrido simples AltaCMS 28-17.2 Linhagem BaixaCMS 28-10.2 Linhagem BaixaCMS 28-11.1 Linhagem BaixaHS 20 x 64 Híbrido simples BaixaHS 723 x 11 Híbrido simples BaixaFigura 1 – Polimorfismo dos produtos da família multigênica GS, depois da separação das bandaspor PAGE nativa e desenvolvimento de cor para a atividade transferase, de folhas de genótiposde milho, contrastantes para EUN e cultivados sob dois níveis de nitrato. Abaixo das bandasaparecem os picos densitometricos das bandas1       2     3     4       5      6      7      8         9     10    11   12     13   14    15   161 - CMS 28-7.1       -        0.8 mM nitrate2 - CMS 28-7.1       -        16 mM nitrate3 - CMS 28-8.1       -        0.8 mM nitrate4 - CMS 28-8.1       -        16 mM nitrate5 - CMS 28-17-2     -        0.8 mM nitrate6 - CMS 28-17-2     -        16 mM nitrate7 - CMS 28-10.2     -        0.8 mM nitrate8 - CMS 28-10.2     -       16 mM nitrate  9 – HS 724 x 22      -     0.8 mM nitrate10 – HS 724 x 22       -     16 mM nitrate11 – HS 723 x 64       -     0.8 mM nitrate12 – HS 723 x 64       -     16 mM nitrate13 – HS 20 x 64         -     0.8 mM nitrate14 – HS 20 x 64         -     16 mM nitrate15 – HS 723 x 11       -     0.8 mM nitrate16 – HS 723 x 11       -     16 mM nitrateFigura 2 – Polimorfismo dos produtos da família multigênica GS, depois da separação das bandaspor PAGE nativa e desenvolvimento de cor para a atividade transferase, de raízes de genótipos demilho, contrastantes para EUN e cultivados sob dois níveis de nitrato.                 Genótipos com baixa EUN                    Genótipos com alta EUN1 – CMS 28-7.1     -     16 mM NO3-   9 – CMS 28-10.2     -     16 mM NO32 – CMS 28-7.1     -     0.8 mM NO3- 10 – CMS 28-10.2     -     0.8 mM NO3-3 – CMS 28-8.1     -     16 mM NO3 11 – CMS 28-17-2     -     16 mM NO34 – CMS 28-8.1     -     0.8 mM NO3- 12 – CMS 28-17-2     -     0.8 mM NO3-5 – HS 724x22      -     16 mM NO3 13 – HS 20x64           -     16 mM NO36 – HS 724x22      -     0.8 mM NO3- 14 – HS 20x64           -      0.8 mM NO3-7 – HS 724x64      -     16 mM NO3 15 – HS 723x11         -     16 mM NO38 – HS 724x64     -       0.8 mM NO3- 16 – HS 723x11         -     0.8 mM NO3-Figura 3 – Isoformas da GS de folhas jovens de milho e tabaco obtidas por PAGE nativa edesenvolvimento de cor pela atividade transferase                                 Mistura completa        Menos ADP          Menos Mg2+                                 para atividade                                 transferasemilho tabaco milho  tabaco milho tabaco    1      2       3      4       5      6      7       8  9    10     11   12    13   14    15    16Figura 4 – Separação das isoenzimas da GS de folhas de milho por PAGE nativa,eletrotransferência para membranas de PVDF  e sondagem com anti-GS1 e anti-GS2                       HS 723 x 64           HS 20 x 64                          HS 723 x 64                HS 20 x 64                    L      H     L    H     L     H      L     H                 L       H     L     H     L     H     L     H                      raiz       folha          raiz          folha                    raiz           folha        raiz         folha                       Sondadas com anti-GS1                                  Sondadas com anti-GS2                L – Plantas cultivadas com  0.8 mM nitrato                H – Plantas cultivadas com 16 mM nitratoAB1   B2    B3  B4  B5 B6  B7A - isoformas da GS separadas porPAGE nativaB1 - banda superior, plantas com baixoN, sondadas com anti-GS2.B2 – ibid, sondada com anti-GS1B3 – banda inferior, plantas com baixoN, sondadas com anti-GS2.B4 - ibid, sondada com  anti-GS1B5 – banda superior, plantas com alto N,sondadas com anti-GS2.B6 –ibid, sondadas com anti-GS1B7 – banda inferior, plantas com alto N,sondadas com anti-GS2. B8 – ibid, sondadas com anti-GS1.Figure 5 - (A) – Separação das isoformas foliares da GS por PAGE nativa edesenvolvimento de cor para atividade transferase B) – As bandas“superiores” e “inferiores”  foram eletroeluidas, separadas por SDS-PAGEe sondadas com anticorpos contra GS1 e GS2. Amostras foliares do HS723x64  foram colhidas quando as plantas tinham 4 folhas completamentedesenvolvidasA

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http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/490115/1/Padroeseletroforeticos.pdf

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