RAGHOTHAMA, K. G.

VASCONCELOS, M. J. V.

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Análise da expressão de genes induzidos por fósforo em genótipos contrastantes de milhoselecionados para eficiência do uso de fósforoMaria José V. Vasconcelos1 e Kashchandra G. Raghothama21 Embrapa Milho e Sorgo, Caixa postal 151, 35701-970, Sete Lagoas, MG.mjose@cnpms.embrapa.br2 Departamento de Horticultura, Purdue University, 47906, West Lafayette, IN , USAPalavras-chave: Fosfato, RNA, Transportadores de fosfato (Pi ), Zea mays L.IntroduçãoO fósforo (Pi) é um dos nutrientes mais importantes para as plantas sendo um componenteintegral de um grande número de compostos importantes presentes nas células, incluindonucleotídeos do metabolismo energético, ácidos nucléicos, fosfolipídios de membrana, entreoutros. Portanto, a deficiência deste elemento na planta compromete de forma geral todo seumetabolismo, causando uma severa redução na produção. Este elemento entretanto está poucodisponível para as plantas devido a sua interação química com cátions no solo, principalmentealumínio e ferro. O íon fosfato presente na solução do solo é absorvido pelas raízes por difusão oque cria uma região de depleção deste elemento na interface solução do solo/superfície radicular.Para restaurar novamente o equilíbrio da solução do solo, ocorre uma desorção do fósforo lábilassociado as micelas de argila do solo. As plantas podem tornar este processo mais eficienteaumentando a sua superfície radicular e/ou melhorando a nível celular, a eficiência de absorçãodeste elemento. A absorção do íon fosfato para o interior das células da raiz, se dáexclusivamente por intermédio de proteínas transportadoras associadas a membrana plasmática.O número destas proteínas transportadoras, assim como a indução de uma classe específica deproteínas transportadoras sintetizada quando a planta sofre estresse de fósforo, podem ser umadas possíveis explicações para o comportamento de maior eficiência ao baixo fósforo quedeterminados genótipos de plantas possuem. Uma outra hipótese, citada na literatura, é a deexudação de ácidos orgânicos pelas raízes, promovendo a liberação do íon fosfato adsorvido naspartículas do solo. A acidificação da rizosfera é observada para um grande número de espécies deplantas como uma resposta à deficiência de fósforo (Gardner et al., 1983; Lipton et al., 1987;Hoffland, et al., 1989; Fuente et al., 1997). Uma das mais recentes respostas moleculares adeficiência de Pi é a indução dos transportadores de fosfato. Neste estudo, nós caracterizamos aregulação da transcrição de seis genes transportadores de fosfato em genótipos de milhocontrastantes para eficiência do uso de Pi.Material e MétodosOs genótipos de milho (Zea mays L.) foram desenvolvidos pelo programa de melhoramento demilho da Embrapa Milho e Sorgo. Estes genótipos foram selecionados baseados em sua respostaa aplicação de Pi como eficiente e ineficiente ao uso de fósforo (Tabela 1).  Sementes de milhoforam germinadas e transferidas para solução nutritiva de Hoaglands meia força e crescidas umasemana em solução completa. Após uma semana parte das plantas foram transferidas parasolução nutritiva sem fósforo e outras para soluções contendo diferentes concentração desteelemento (0, 5, 10, 25, 50, 100 e 250 µM de Pi). Durante o experimento as soluções nutritivasforam trocadas a cada dois dias para manter o pH e a concentração dos nutrientes. Após 15 diasde tratamento, raiz, caule e folhas foram coletados e congeladas em N2 líquido e armazenadas a -80 oC. RNAs foram extraídos pelo método de fenol para as  análises por Northern blot.Tabela 1. Material genéticoGenótipos de MilhoEficiente IneficienteL-03 L-16L-11 L-22L-36 L-723L-161-1 L-5046Resultados e DiscussãoA nível molecular muitos estudos têm considerado o efeito do estresse de fósforo e sua aquisiçãopela interface raiz:solo. Estudos tem demonstrado que o baixo fósforo tem induzido genestransportadores de fósforo (Davies et al., 2002; Mudge et al., 2002; Shin et al., 2004), RNAses efosfatases (Bariola et al., 1994; Abel et al., 2000). O arranjo da resposta molecular tem sidoassociado com o aumento da  exploração do solo, liberação do Pi de formas complexas e suaaquisição. Muitos deste estudos indicaram a resposta molecular da planta a deficiência de fósforo,mas ainda não é conhecido onde esses atributos moleculares têm contribuído para o uso eficientede fósforo pela planta. Desde que transportadores de alta afinidade de fosfato (Pi) mostraram suaindução em resposta ao Pi estresse em diferentes espécies de planta (Raghothama, 1999), nóscaracterizamos seis transportadores de Pi em milho (ZmPTs - Patente nº W09958657) obtidos daPioneer Hybrid Co.  A seqüência de aminoácidos destes transportadores revelou alta homologiacom transportadores de Pi de aveia, Arabidopsis, tomate, sorgo e arroz (Figura 1). Resultadosmostraram que os transportadores de Pi em milho são induzidos quando a planta de milho écrescida em baixa concentração de Pi (0-25 µM) (Figura 2). Desde que este genes tem suaindução em baixo Pi, isto leva a concluirmos que os transportadores de Pi de alta afinidadedesempenham um papel crítico na aquisição de fósforo pela planta. O padrão de expressãotemporal dos transportadores de Pi em milho tiveram similar resposta. Entretanto, o papel do Pina regulação da transcrição destes transportadores pode ser demonstrada quando plantas de milhoforam re-supridas com fosfato (Figura 3).Os resultados obtidos concordam com estudos anteriores onde transportadores de Pi de altaafinidade em diferentes espécies de planta tem sido regulados por Pi (Karthikeyan et al., 2002;Daram et al., 1998; Liu et al., 1998). Vários estudos sugerem que a expressão dos genes quecodificam transportadores de fósforo para alta afinidade tem sua  transcrição regulado emresposta ao Pi da planta..Figura 1. Análise filogenética de transportadores de fosfato em plantas. Árvore filogenética foidos transportadores de fosfato foi construída usando-se o ClustalX. NJ-plot.Abreviaturas mostra os respectivos transportadores. ZmPT Zea mays fosfatotransporter; AtPT Arabidopsis thaliana fosfato transporter; LePT Lycopersiconesculentum fosfato transporter; OsPT Oryza sativa fosfato transporter; HvPT Hordeumvulgare fosfato transporter; SbPT Sorghum bicolor fosfato transporterFigura 2. Northern blot dos genes ZmPTs induzidos sob estresse de fósforo.  RNA total isoladode plantas de milho crescida em meia força de solução nutritiva de Hoaglandsmodificada (Li et al., 1997) contendo diferentes concentrações de Pi (0, 5, 10, 25, 50,100 e 250 µM) por 15 dias.  Todas as sondas foram  marcadas com 32P. O painelabaixo do Northern blot foi corado com brometo de etidio para demonstrar aintegridade e a uniformidade do RNA.Figura 3. Northern blot dos genes ZmPTs induzido sob estresse de fósforo e re-suprido com Pi.RNA total isolado de milho crescidos em meia força de solução nutritiva de Hoaglandsmodificada (Li et al., 1997) contendo  0 µM por 15 dias.  Após 15 dias as plantasforam re-supridas com 250 µM de Pi. Todas as sondas foram  marcadas com 32P. Opainel abaixo do Northern blot foi corado com brometo de etidio para demonstrar aintegridade e a uniformidade do RNA.Literatura citadaAbel S, Nurnberger T, Ahnert V, Krauss G-J, Glund K (2000) Induction of an extracellularcyclic nucleotide phosphodiesterase as an accessory ribonucleolytic activity duringphosphate starvation of cultured tomato cells. Plant Physiol 122: 543-552Bariola PA, Howard CJ, Taylor CB, Verburg MT, Jaglan VD, Green PJ (1994) TheArabidopsis ribonuclease gene RNS1 is tightly controlled in response to phosphatelimitation. Plant J. 6: 673-658Daram P, Brunner S, Persson BL, Amrhein N, Bucher M (1998) Functional analysis and cell-specific expression of a phosphate transporter from tomato. Planta 206: 225-233Davies TGE, Ying J, Xu Q, Li ZS, Li J, Gordon-Weeks R (2002) Expression analysis ofputative high-affinity phosphate transporters in Chinese winter wheats. Plant Cell Envirn25: 1325-1339Fuente, J. M.; Rodríguez, V. R.; Ponce, J. L. C.; Estrella, L. H. Aluminum tolerance intransgenic plants by alteration of citrate synthesis. Science, 276: 1566-1568, 1997.Gardner, W. K., Barber, D. A., Parbery, D. G. The acquisition of phosphorus by Lupinusalbus L. III. The probable mechanism by phosphorus movement in the soil/root interface isenhanced. Plant and Soil, 70: 107-124, 1983.Hoffland, E., Findenegg, G. R., Nelemans, J. A. Solubilization of rock phosphate by rape. Plantand Soil, 113:161-165, 1989.Karthikeyan AS, Varadarajan DK, Mukatira UT, D'Urzo MP, Damsz B, Raghothama KG(2002) Regulated expression of Arabidopsis phosphate transporters. Plant Physiol 130: 221-233Lipton, G. S., Blanchar, R. W., Blevins, D. G. Citrate, malate and succinate concentration inexudates from P-sufficient and P-stressed Medicago sativa L. seedlings. 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Análise da expressão de genes induzidos por fósforo em genótipos contrastantes de milho, selecionados para eficiência do uso de fósforo.

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