LUCIO, C. H.

MARRIEL, I. E.

PINTO, N. F. J.

SILVA, P. G. da

SOARES, E. M.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

µBiossíntese e quantificação de aflatoxinas B1 em grãos de milho, arroz e sorgoinoculados com Aspergillus flavus  através da técnica ELISACÉSAR H. LÚCIO1, NICÉSIO F J PINTO3, EMANUELA M. SOARES2, IVANILDO E.MARRIEL31UNI-BH, 2PUC Minas; 3Embrapa Milho e Sorgo, 35700-000, Sete Lagoas - MG, Brasil; E-mail: imarriel@cnpms.embrapa.brPalavras-chave: fungo, determinação de micotoxinas, cereais, método rápidoIntroduçãoAs aflatoxinas constituem uma das classes de micotoxinas que ocorrem naturalmenteem commodities agrícolas. Os cereais tornaram-se importantes para o agronegócio brasileiro,principalmente, em razão de seu papel como ingredientes na  agroindústria de rações parasuínos e aves, que contribuem de modo significativo para a pauta de exportação brasileira.As micotoxinas são um grupo de metabólitos secundários quimicamente diversosproduzidos por diferentes espécies de fungos, principalmente, dos gêneros Aspergillus,Fusarium, e Penicillium, sendo as mais comuns: aflatoxinas, ochatoxina A, fumosinas ,tricotecenos e zearalenonas (CHEEKE & SHULL, 1985; GILBERT & VARGAS, 2003).Essas substâncias produzem uma ampla gama de efeitos tóxicos e adversos à saúde animal,inclusive humana (CAST, 2003). Em suínos, a intoxicação com aflatoxinas resulta em perdade peso, redução da conversão alimentar e imunodepressão, (MALLMANN et al., 1994;SANTOS et al, 1986) e, em aves, em menor ganho de peso e menor consumo de ração, menorprodução e peso dos ovos, podendo resultar em morte dos animais, ocasionando grandesperdas econômicas para o agronegócio e riscos para a saúde humana (Caldas et al., 2002).Entre os 18 tipos diferentes de aflatoxinas produzidas na natureza, a aflatoxina B1(AFB1) é considerada a de maior toxidade, sendo produzida principalmente por Aspergillusflavus, A. niger e A. parisiticus (SMITH & ROSS, 1991; DUTON, 1988). Os alimentos eingredientes utilizados nas dietas de animais são contaminadas com aflatoxinas antes dacolheita, durante o tempo entre colheita e secagem e durante o período de  armazenamento(WILLIAM, 1991; PRADO et al., 1995).Atualmente, existem normas regulatórias para as principais micotoxinas em pelomenos 100 países, na maioria dos casos para aflatoxinas, sendo os níveis de tolerânciamáxima bastante variáveis (VAN EGMOND & JONKER, 2003). Zheng et al, (2006) citamque, nos USA, os alimentos em geral devem apresentar valores máximos de 20 µg kg-1,enquanto para os componentes de ração, esses valores variam de 100  a 300 µg kg-1,dependendo do produto, finalidade e idade de animais.No Brasil,  de acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abasteciemento eMinistério da Saúde, o limite de tolerância varia entre 20 e 30 µg kg-1 para aflatoxinas totaisem alimentos e matéria prima para rações, respectivamente. Portanto, torna-se necessário omonitoramento da presença de AFB1 para garantir a eficácia das medidas de segurançaalimentar, o alcance de metas logísticas e operacionais da indústrias e a circulação rápida decommodities e produtos através dos mercados, economizando tempo e custo (SCANLAN,2005). Os métodos analíticos convencionais para micotoxinas incluem cromatografia decamada fina, cromatografia líquida de alta resolução e cromatografia gasosa (GILBERT &VARGAS, 2003; ZHENG et al., 2006), mas em razão de extensivas etapas na preparação dasamostras antes da análise, as vezes, torna-se limitada sua aplicação prática (COTY, 1998).Como alternativas, tem sido utilizados métodos imunoquímicos, considerados rápidos, ebarato. Dentre esses métodos, a técnica ELISA (enzyme –linked immunosorbent assay), queinclui testes diversos, tem sido utilizada por mais de uma década em análises de micotoxinas(CHU, 1996), principalmente os testes competitivos (RAMARISHMA & MEHAN, 1993).Esta tecnologia baseia-se na habilidade de um anticorpo específico para distinguir a estruturatridimensional de uma micotoxina específica.Como vantagens, os testes baseados na técnica ELISA podem ser quantitativos,simples, específicos, sensíveis e requerem pequenos volumes de amostras, e exigemprocedimentos simples de extração, comparados métodos analíticos convencionais,permitindo processamento de um grande número de amostras em tempo relativamente curto.ObjetivosAdaptar e avaliar o teste ELISA indireto não competitivo para detecção e quantificação deaflatoxina B1 em cereaisAvaliar a influência do tipo de grão sobre a produção de aflatoxina B1Material e MétodosCultura de Aspergillus flavus nos grãos e meio de cultura: O isolado de Aspergillus flavusdo banco de microrganismos do Laboratório de Microbiologia e Bioquímica do Sol daEmbrapa Milho e Sorgo foi cultivado em meio ágar-batata durante 10 dias à temperaturaambiente. A partir das placas, foi preparada uma suspensão de micélios e esporos, pela adiçãode PBS. Cinco ml de suspensão foi utilizada para inocular 150 g de grãos de milho, sorgo e dearroz, previamente desinfestados com cloramina T 1%, contidos em erlenmeyers de 500 ml.No caso do meio de cultura, 50 ml de caldo tripticaseina de soja, em erlenmeyers de 125 ml,foram inoculados, foram com 1 ml da suspensão de fungos. Em ambos os casos, utilizaram-setrês repetições.Preparação dos Extratos: Após 12 dias de incubação dos erlenmeyers, amostras de 10g degrãos (milho, arroz e sorgo) tratados com a suspensão do fungo foram trituradas em cadinhosde porcelana, em 50 ml de metanol 70% em solução de KCl 0,5%. Em seguida, as suspensõesforam centrifugadas a 6000 x g, durante 6 minutos e filtradas em papel watmann, no4.Osobrenadante foi mantido a -180C.Foram analisadas quatro repetições de cada amostra.ELISA indireto não competitivo: basicamente, as placas ELISA contendo100 ul de cadaextratos ( ou solução de aflatoxina pura) por cavidade foram incubadas durante a noite , 37C.No dia seguinte, as placas foram lavadas 3x com PBS-T e tratadas com PBS caseina durante1hora à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram lavadas novamente de modosimilar e 100 ul de solução de antissoro monoclonal anti AFB1 (sigma) na diluição 1:5000foram aplicados por cavidade. Após duas horas a temperatura ambiente  e lavagem das placas,foram aplicados, em cada cavidade, 100 ul do conjugado fosfatase- anti-IgG de camundongo,diluída 1:3000 em PBS-T. Incubou-se novamente por duas horas a temperatura ambiente.Após a lavagem final, foram adicionados 100 ul da solução do substrato, p-nitrofenol fosfato(1mg/ml) e a reação foi determinada pela leitura de absorbância a 405 nm.Ajustes de concentrações ótimas dos extratos: Cinco diluições de cada extrato (1:5, 1:10,1:20; 1:40 e 1:80) em tampão de carbonato de sódio, em duplicats,  foram utilizadas comoantígenos para sensibilização das placas ELISA e condução das reações como descrito acima.Ajustes de concentrações ótimas dos reagentes e limite de detecção de AFB1: Asconcentrações de AFB1 (1, 5, 10, 15, 20, 20, 25, 50, 200, 200, 400 e 800 µg kg-1) preparadascom AFB1 padrão (sigma) foram avaliadas como antígeno no teste ELISA indireto emcombinação com as seguintes concentrações de antisso anti AFB1 (diluições 1:2500, 15000,1:10000, 1:20000; 1:30000; 1:40000 e 1:50000). As reações foram conduzidas como descritono teste ELISA indireto.Estimativa das concentrações de AFB1 nos extratos: A curva padrão para se estimar asconcentrações de AFB1 foi feita partir da preparação de sete concentrações (0, 5,10,20, 80,160, e 320 µg kg-1) de aflatoxina B1 pura ( sigma). Essas soluções foram utilizadas parasensibilização das placas ELISA, de acordo com o procedimento já descrito para o teste deELISA indireto. Foram analisadas nove repetições de cada amostra. As leituras obtidas foramutilizadas para cálculo e  ajuste da curva padrão.Resultados e DiscussãoNos ensaios preliminares para o ajuste de concentrações ótimas dos reagentes purospara o teste ELISA indireto não competitivo, utilizando 11 concentrações do antígeno,AFB1(1 a 800 µg kg-1) combinadas com 8 concentrações do antissoro anti-AFB1(diluição1:2500 a 1:50000), foram detectadas reações positivas em todos os casos e indicarama diluição 1: 5000 como a mais adequada para os bioensaios de biossíntes e de quantificaçãoda produção de AFB1. Os resultados destes testes indicaram ainda um limite de detecçãoabaixo de 5,0 µg kg-1, o que mostra o potencial deste método para o monitoramento daprodução de AFB1, considerando-se o nível de tolerância no Brasil entre 20 e 30 µg kg-1Esses resultados são consistentes com os relatados por (WANG et al., 2006), que relatamlimite de detecção de até 1,0 µg kg-1 em grãos utilizando o teste ELISA competitivo.A produção de AFB1 detectada nos quatros substratos testados, apresentada na Fig. 1,foi estimada através da equação Y=0,1343*(1-exp(0,006128*X)), (R2=0,9513**). Notam-sediferenças significativas entre os valores observados para a biossíntese de AFB1 entre asamostras em função do tipo de grãos. Foram detectados 485,9 µg kg-1 em sorgo, 55,2 µg kg-1em milho e 52,4 µg kg-1 em arroz e 243,0 µg kg-1 em meio de cultura líquido. A menorquantidade de AFB1 detectada em arroz e milho demonstram que a presença do fungo nãoimplica necessariamente em altas produção de AFB1, considerando-se que ocorreucrescimento acentuado do fungo também nestas amostras (não mostrado).Vale ressaltar que o valor encontrado em meio de cultura pode estar subestimado.Neste caso, foi considerada somente AFB1 extracelular, acumulada no meio e não aacumulada na massa micelial do fungo. Sabe-se que a produção de aflatoxina micelial podesuperar a encontrada em meio de cultura (Chung et al., 1989). Pode-se especular que aprodução de AFB1 observada depende do isolado de fungo testado, pois a produção deFigura 1. Biossínte de aflatoxina B1, em cereais e em meio de cultura líquidoinoculados com Aspergillus Flavus, detectada através do teste ELISAindireto não competitivo, após 12 de incubação à temperatura ambiente.Valores médios de quatro repetições.esterigmatocistina (precursor da AFB1) difere entre isolados de dois fungos em até 10 vezes(CHUNG et al., 1989).Observou-se ainda uma variação elevada entre entre repetições da cada amostrarevelados pelos desvios padrão das médias (Fig 1), exceto para o meio de cultura. .Neste caso,essa variação foi menor, em torno de 21%, comparados com os valores observados nasdemais amostras onde se observou variação entre 43, 50 e 75% para o desvio padrão dasmédias, em sorgo, milho e arroz, respectivamente. Esses fatos evidenciam uma distribuiçãoheterogênea de AFB1 nos grãos, o que implica em cuidados especiais com a amostragem emanálises desta natureza. Amostragem em análise de aflatoxinas em grãos tem recebido atençãoem diferentes pesquisas (WHITAKER & DICKENS, 1979; GILBERT & VARGAS, 2003).Em razão da simplicidade, sensibilidade e rapidez do método avaliado, os resultadosdemonstram que o teste ELISA indireto não competitivo pode ser utilizado para aquantificação de AFB1 em cereais, permitindo análises de grande de amostras, com custosbaixos. Entretanto, para o uso rotineiro deste teste torna-se essencial e crítico a sua validaçãode acordo com a demanda de cada laboratório em função da natureza e tipos de amostras aserem analisadas, conforme comentado em outras pesquisas (GILBERTO & ANKLAM,2002; ZHENG et al., 2005)Conclusões1. Os resultados demonstram que AFB1 pode ser efetivamente monitorada em cereais,através do método ELISA indireto não competitivo, com limite detecção abaixo de 5,0 µgkg-1.2.  Os grãos de sorgo inoculados com Aspergillus Flavus favorecem a biossíntese de AFB1,comparados com os de milho e de arroz.3. A produção de AFB1 em cereais inoculados com Aspergillus flavus depende do tipo degrãos0100200300400500600700800Milho Arroz Sorgo Meio de culturaSubstratosConcentração de Aflatoxina( µ g kg-1)Literatura citadaCALDAS, E,D; SILVA, S, C & OLIVEIRA, J, N,. Aflatoxinas e ocrotoxina A em alimentose riscos para a saúde humana, Rev. Saúde Pública;. 36: 319-323. 2002Cheeke, P.R. and Shull, L.R. (1985) Mycotoxins (Chap. 12). In: Natural toxicants in feedsand poisonous plants. AVI. pp393-477.Chu FS. Recent studies  on immunoassays for mycotoxin. In:Beier RC, Stanker LH, eds.Immuassays for Residue Analysis, American  Chemical Society,  Washington,  DC,1996:294-313.CHUNG D., ABOUZIED M.M, PESTKA J.J. Immunochemical assay applied to mycotoxinbiosynthesis: Elisa comparison of sterigmatocystin production by Aspergillus versicolor andAspergillus nidulans. Mycopathologia 107:93-100. 1989,Council for Agricultural Science and Technology (CAST).Mycotoxins: Risks in Plant, Animaland Human Systems. Task Force Report, No.139, CAST, Ames, Iowa,2003DUTTON M.F.,Enzyme and aflatoxin biosynthesis. Microbiol Rev:52:274-95. 1988Gilbert J, Anklam E. Validation of analytical methods for determining mycotoxins in foodstuffs.Trends Anal Chem;21(6-7):468-486. 2002GILBERT J.,VARGAS,E.A., Advances in Sampling and Analysis for Aflatoxins and AnimalFee. ,Journal of Toxicology-Toxin Reviews, v.22 p.381-422. 2003,MALLMAN, C.A.,SANTURIO, J.M,WENTS L.Aflatoxinas-Aspectos Clínicos eToxicológicos em Suínos.Ciência Rural,Santa Maria, v.24,n.3,p.635-643. 1994,PRADO, G, PINTO, N, J, A. & OLIVEIRA, M.S, Incidência de aflatoxina em milho(ZeamaysL.) com diferentes níveis de umidade, após tratamento com fungicida, armazenado ematmosfera com e sem aeração, Rev. Inst. Adolfo Lutz. 1995, 55 (2): 79-84RAMAKRISHMA,N. & MEHAN, VK, Direct and indirect competitive monoclonal anti-body-based ELISA of Aflatoxin B1 in groundnut, Mycotoxin Research, 1993, 9, 1, 53-63SANTOS, J.L. dos, RIBEIRO, M.F.B., SILVA, J.C.P da, . 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Biossíntese e quantificação de aflatoxinas B1 em grãos de milho, arroz e sorgo inoculados com Aspergillus flavus através da técnica ELISA.

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