ALVES, V. M. C.

GUIMARAES, C. T.

KOCHIAN, L. V.

LANA, U. G. de P.

MAGALHAES, J. V. de

SCHAFFERT, R. E.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

1Caracterização Molecular do Gene SbMATE, Principal Responsável pela Tolerância aoAlumínio em Sorgo Ubiraci G. P. Lana 1, Claudia T. Guimarães 1, Vera M. C. Alves 1, Robert E. Schaffert 1, Leon V.Kochian 2 e Jurandir V. Magalhães 11 Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG 35701-970.2 U.S. Plant and Soil Nutrition Laboratory, Cornell University, USA.Palavras-chave: Tolerância ao Al, Sorghum bicolor, SbMATE.No Brasil, uma das principais limitações à produção vegetal é a toxidez do alumínio (Al).O desenvolvimento de genótipos tolerantes ao alumínio requer a identificação tanto de genesquanto de alelos que possuam efeitos superiores na expressão da tolerância. Nesse sentido, váriosesforços têm sido direcionados para aumentar o conhecimento acerca da tolerância ao Al emsorgo. Um gene que explica 80% da variação fenotípica da tolerância ao alumínio foi mapeado naregião terminal do cromossomo 3 de sorgo por Magalhães et al. (2004), sendo denominado AltSB.Utilizando marcadores que flanqueiam o gene AltSB em populações derivadas do cruzamento de11 linhagens de sorgo com amplo espectro de tolerância ao alumínio com uma linhagem sensível(BR012), Caniato et al. (2007) constataram a existência de diferentes alelos no loco AltSB, alémde novos genes envolvidos na tolerância ao Al. O gene AltSB foi isolado por meio da estratégia declonagem baseada em mapa e codifica um membro de uma família de transportadores demembrana (SbMATE), responsável pelo efluxo de citrato em raízes de sorgo (Magalhães et al.,2007). Com base na seqüência do gene SbMATE torna-se fundamental estudar e caracterizar o(s)mecanismo(s) que controlam a variabilidade alélica nesse loco. Assim, o presente trabalhoobjetivou o estudo da estrutura e da expressão do gene SbMATE entre linhagens de sorgo comampla variabilidade para a tolerância ao alumínio.Foram utilizadas as 12 linhagens de sorgo previamente caracterizadas por Caniato et al.(2007), denominadas BR007B, BR012R, 5DX61/6/2, 9DX9/11, 3DX57/1/1/910, SC112-14,SC175-14, SC283, SC549, SC566, IS8577, CMSXS225R; além do genótipo BTx642, que fazemparte do programa de melhoramento genético da Embrapa Milho e Sorgo. As sementes foramgerminadas segundo Caniato et al. (2007) e os experimentos conduzidos com cinco atividades deAl: {0}, {11}, {20}, {27} e {39} µM. Para obtenção de uma curva de resposta ao Al ao longo deum período de seis dias, calculou-se a taxa de crescimento radicular (mm/dia) a partir dasinclinações das curvas de crescimento em cada atividade de Al ao longo do tempo. As curvasforam agrupadas por meio do algoritmo HaiNet.Para o seqüenciamento do gene SbMATE foram utilizados iniciadores segundo Magalhãeset al. (2007). Os fragmentos foram purificados com “QIAquick Gel Extraction Kit“ (Qiagen,Valencia, CA) e seqüenciados com kit “Big Dye Terminator v3.1” (Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA). As amostras foram analisadas no seqüenciador ABI3100 (Applied Biosystems),a qualidade das seqüências avaliada pelo programa Seqman 3.57 (DNAstar, Madison, WI) e asseqüências selecionadas foram alinhadas pelo programa ClustalW.2Visando a análise de expressão do gene SbMATE, foram cultivadas plântulas de cada umdos 13 genótipos de sorgo na ausência e na presença de {27} µM de Al. O experimento foiconduzido segundo o delineamento inteiramente casualizado com três repetições. As médiasforam comparadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de significância. Foram coletados ápicesradiculares (1 cm) de dez plântulas cultivadas por três dias sob estresse de Al ou na condiçãocontrole. As amostras de RNA foram extraídas com o “RNeasy Plant Mini Kit” (Qiagen,Valencia, CA). Para a síntese do DNA complementar utilizou-se do kit de “SuperScript II RT”(Invitrogen, Carslbad, CA). Os iniciadores utilizados para amplificar o gene SbMATE foram:JL57 (5´ GTGCTGGATCCGATCCTGAT 3´) e JL58 (5´CACTGCCGAAGAAACTTCCA 3´).Já para o gene controle, β-actina, foram utilizados os primers ActR (5´GATCCACATCTGTTGGAACG 3´) e ActF (5´ TGATGAAGATTCTCACTGAG 3´).Após definição dos ciclos de amplificação do PCR semi-quantitativo, as condições dareação em multiplex foram realizadas em um volume final de 20 µL, consistindo de 2 µL decDNA; 20 mM Tris-HCl (pH 8,4); 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 0,5 U Taq DNA polimerase(Invitrogen, Carslbad, CA); 0,125 mM dNTPs e 10 ρmols de cada iniciador. As condições deamplificação foram: desnaturação inicial a 94oC por 1 minuto, 30 ciclos de 94oC por 30segundos, 60oC por 40 segundos e 72oC por 90 segundos, elongação final a 72oC por 5 minutos,mantendo a reação à 4oC. Os produtos foram quantificados utilizando-se do programa“ImageQuant” (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Os dados de expressão do gene SbMATEforam normalizados utilizando a razão entre as intensidades dos produtos do gene e da β-actina.O agrupamento das curvas de crescimento permitiu a caracterização das linhagens emquatro grupos distintos (Figura 1).Figura 1. Agrupamento das curvas de crescimento radicular de 13 genótipos de sorgo em soluçãonutritiva na ausência e presença de diferentes atividades de Al. O valor b representa a inclinação dascurvas de crescimento radicular ao longo de seis dias.-3-2-101230 10 20 30 40Atividade de A l (uM )-3-2-101230 10 20 30 40-3-2-101230 10 20 30 40-3-2-101230 10 20 30 40-3-2-101230 10 20 30 40A B C Db ( mm/dia)Atividade de Al (µM)SC283   BR007   SC566   3DX   BR012   CM S225   SC112   5DX   9DX   SC549   SC175   IS8577   TX642   BR007   BR012   TX642   SC283   SC566   CM S225   3DX   5DX   9DX   SC549   SC175   SC112   IS8577   b ( mm/dia)3No grupo A, as linhagens BR007, Tx642 e BR012 tiveram o crescimento radicular inibidoà {11} µM de Al, caracterizadas como sensíveis. As linhagens SC112 e IS8577, pertencentes aogrupo B, mostraram uma indução no crescimento radicular até a atividade de 11 µM de Al, apartir da qual foi observada uma inibição no crescimento, com uma drástica redução à {20} µMde Al. Essas linhagens podem ser consideradas moderadamente tolerantes. No grupo C foramincluídas as linhagens 3DX, SC175, SC549, 9DX e 5DX, que apresentaram um aumento da taxade crescimento radicular até as atividades de 20 µM (3DX e SC549) ou 27 µM de Al (SC175,5DX e 9DX), a partir das quais houve uma acentuada inibição no crescimento radicular. Essegrupo foi considerado tolerante. As linhagens CMS225, SC283 e SC566, agrupadas em D,apresentaram taxas de crescimento praticamente constantes até a atividade de 39 µM de Al,novamente demonstrando uma tolerância superior em relação às demais linhagens. Enquanto aslinhagens sensíveis não apresentaram nenhum tipo de indução, as linhagens moderadamentetolerantes mostraram um comportamento indutivo ao longo das atividades de Al. Já as linhagenstolerantes mostraram uma indução no crescimento radicular ao longo do tempo e das atividadesde Al. As linhagens altamente tolerantes (CMS225, SC283 e SC566) apresentaram umcomportamento indutivo ao longo do tempo e taxas de crescimento constantes nas diferentesdoses de alumínio. A existência de duas respostas indutivas distintas verificadas entre aslinhagens pode indicar a atuação de diferentes mecanismos no controle da tolerância ao alumínio.O alinhamento das seqüências do gene SbMATE revelou um reduzido número depolimorfismos na região codificadora entre as linhagens de sorgo. Onze dos treze genótipos nãoapresentaram variação na seqüência de nucleotídeos do gene, incluindo desde linhagens sensíveiscomo BR007 até linhagens altamente tolerantes como SC283. Um dos polimorfismosencontrados foi na linhagem SC566, onde houve uma única substituição de timina (T) poradenina (A) no primeiro éxon do gene. Uma notável exceção foi observada na linhagem Tx642,que apresentou uma grande quantidade de polimorfismos ao longo do gene, incluindosubstituições de nucleotídeos únicos (SNPs), inserções e deleções.Assim, a variabilidade na tolerância ao Al verificada entre as treze linhagens de sorgo nãopôde ser explicada pelas variações estruturais na seqüência do gene SbMATE, uma vez que tantolinhagens altamente tolerantes quanto sensíveis apresentaram o mesmo haplótipo. A mutaçãoobservada no haplótipo da linhagem SC566 resultou na troca do aminoácido leucina pelahistidina, localizada no quarto domínio transmembrânico. Apesar de a troca ter ocorrido entre umaminoácido hidrofóbico por um hidrofílico, a estrutura secundária predita da proteína não sofreualteração significativa. Já os polimorfismos da linhagem Tx642 ocasionaram uma mudança damatriz de leitura, resultando no aparecimento de um códon de terminação prematuro, econsequentemente em uma proteína predita de apenas 241 aminoácidos sem oito domínios.A expressão relativa do gene SbMATE possibilitou a classificação das linhagens emquatro grupos pelo teste de Scott-Knot a 5%. As linhagens BR007, Tx642, SC112 e BR012apresentaram uma baixa expressão do gene SbMATE e, com exceção da SC112, foramclassificadas como sensíveis ao Al. As linhagens SC112 e IS8577 apresentaram padrões decrescimento radicular muito parecidos e foram classificadas como moderadamente tolerantes.Apesar de ambas as linhagens serem igualmente classificadas com relação à tolerância ao Al, aexpressão do SbMATE em SC112 foi duas vezes menor que na linhagem IS8577. O padrão deexpressão desse gene na linhagem SC112 corrobora com os dados de Caniato et al. (2007) quedemonstraram que a tolerância ao Al nessa linhagem não é controlada por esse gene. As4linhagens SC549, 3DX, 5DX, 9DX e SC175 apresentaram uma expressão intermediária do geneSbMATE e foram classificadas como tolerantes ao Al. Dentre essas linhagens, 3DX e 5DXapresentam uma similaridade genética de 100% considerando resultados de quinze marcadoresmicrossatélites (Caniato et al., 2007). Apesar de ambas terem sido agrupadas como tolerantes, asuperioridade na tolerância ao Al de 5DX em comparação com 3DX é ressaltada pela taxa decrescimento (Figura 1). Caniato et al., (2007) sugerem que a maior tolerância da 5DX pode seradvinda da introgressão de genes diferentes do SbMATE. As evidências apresentadas suportamessa hipótese, uma vez que os níveis de expressão do gene SbMATE na presença do Al nessaslinhagens foram muito similares, sugerindo que herdaram o mesmo alelo. Assim, a maiortolerância ao Al da linhagem 5DX seria realmente conferida por gene(s) distinto(s) ao SbMATE.As linhagens CMS225, SC283 e SC566 apresentaram os maiores níveis de expressão doSbMATE e foram consideradas altamente tolerantes ao Al de acordo com a taxa de crescimentoradicular. A linhagem SC283 é um padrão de tolerância ao Al, sendo utilizada como fonte para aclonagem do gene SbMATE (Magalhães et al., 2007). Mesmo tendo sido agrupada juntamentecom CMS225 e SC283, a linhagem SC566 apresentou um maior crescimento radicular sobestresse de alumínio. Tal tolerância pode estar relacionada tanto à maior expressão do geneSbMATE na presença do alumínio quanto à mutação não-sinônima no primeiro éxon, que alterouum aminoácido no quarto domínio transmembrânico da proteína predita. Como resultado, alinhagem poderia ter um transportador de membrana mais eficiente e/ou um maior número deles.A correlação de 0,9511 (p < 0,0001) entre a expressão relativa do gene SbMATE e ocrescimento líquido relativo da raiz seminal à {27} µM de Al obtido por Caniato et al. (2007),sugere que a tolerância ao alumínio em sorgo é primariamente condicionada pelo nível deexpressão do gene SbMATE. Assim, a variação alélica no loco SbMATE associada aos diferentesníveis de tolerância ao alumínio, encontrada por Caniato et al. (2007), poderia ser explicada pelosníveis de expressão desse gene. A regulação da expressão do gene SbMATE parece ser o pontochave do processo de tolerância ao Al em sorgo, de maneira que a diversidade alélicapreviamente identificada no loco SbMATE pode estar relacionada a variantes envolvidos nocontrole transcricional. Assim, estudos envolvendo a caracterização da região promotora do geneSbMATE podem permitir um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios associados aodiferentes níveis de tolerância ao alumínio em sorgo.Referências bibliográficasCANIATO, F. F.; GUIMARÃES, C. T.; SCHAFFERT, R. E.; ALVES, V. M. C.; KOCHIAN, L. V.;BORÉM, A.; KLEIN, P. E.; MAGALHÃES, J. V. Genetic diversity for aluminum tolerance in sorghum.Theoretical and Applied Genetics, v. 114, p. 863-876, 2007.MAGALHÃES, J. V.; GARVIN, D. F.; WANG, Y.; SORRELLS, M. E.; KLEIN, P. E.; SCHAFFERT, R.E.; LI, L.; KOCHIAN, L. V. Comparative mapping of a major aluminum tolerance gene in sorghum andother species in the Poaceae. Genetics, v.167, p.1905-1914, 2004.MAGALHÃES, J. V.; LIU, J.; GUIMARES, C. T.; LANA, U. G. P.; ALVES, V. M.; WANG, Y-H;SCHAFFERT, R. E.; HOEKENGA, O. A.; PIÑEROS, M.A.; SHAFF, J.E.; KLEIN, P.; CARNEIRO,N.P.;  COELHO, C. M.; TRICK, H.N.; KOCHIAN, L. V. A gene in multidrug and toxic compoundextrusion (MATE) family confers aluminum tolerance in sorghum. Nature genetics, v.39, p.1156-1161,2007.

Caracterização molecular do gene SbMATE, principal responsável pela tolerância ao alumínio em sorgo.

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