ALVES, J. D.

GAMA, E. E. G.

LOPES, M. J. C.

MAGALHAES, M. M.

MAGALHAES, P. C.

SOUZA, I. R. P. de

VILLAFORT, M. T.

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1Atividade da Enzima Peroxidase do Ascorbato em Plântulas de Diferentes Ciclos de Seleçãodo Milho ‘ Saracura’ sob Encharcamento ContínuoMarcus J. C. Lopes1, Isabel R. P. Souza2, Paulo C. Magalhães2, Elto E. G. Gama2, José D. Alves3,Marcelo M. Murad 3 e Mina T. Villafort41 Estudante de Doutorado em Agronomia/ Fisiologia Vegetal pela UFLA, Lavras, MG 2 EmbrapaMilho e Sorgo, Sete Lagoas, MG.  3 UFLA, Dep. de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal.4Estudante de Ciências Biológicas, UFLA.Palavras-chave: hipoxia, seleção massal, ápice radicular, BRS-4154 e BR107.INTRODUÇÃOA variedade Saracura “BRS-4154”, tolerante ao encharcamento intermitente, vem sendomelhorada através da seleção massal estratificada, em solos de várzea, desde o seudesenvolvimento. Diversos trabalhos tem sido realizados na Embrapa Milho e Sorgo eUniversidade Federal de Lavras para determinar os possíveis mecanismos de tolerância do milho‘Saracura’ ao encharcamento. Dentre as enzimas antioxidantes, envolvidas em resposta a diversosestresses abióticos, como ozônio e salinidade, tem sido mencionada a peroxidase do ascorbato(APX), que utiliza o ascorbato como doador específico de elétron na redução do peróxido dehidrogênio (H2O2) à água (Asada, 1997, Shigeoka et al., 2002) e cujas isoformas são encontradasnos cloroplastos, mitocôndria, perixossomos e no citosol (Cakmak et al., 1993). Além disso, aAPX é indispensável para a proteção de cloroplastos e outros constituintes celulares dos danos doH2O2  e do radical hidroxila (Asada, 1992). Nas células das plantas, o ciclo ascorbato/glutationarepresenta um mecanismo de detoxificação alternativo e mais eficiente contra H2O2 gerado nocloroplasto e citosol (Cakmak et al., 1993). O H2O2 é removido em série de reações enzimáticasque envolvem, dentre outras enzimas, a redutase da glutationa (GR) e APX.  O presente trabalhoteve como objetivo analisar a atividade da APX na cultivar Saracura, sob encharcamentocontínuo.MATERIAL E MÉTODOSO experimento foi conduzido em casa de vegetação, na área experimental da Embrapa Milho eSorgo, Sete Lagoas, MG.  Sementes dos ciclos de seleção do ‘Saracura’: C1, C8 e C16 e datestemunha ‘BR 107’ foram plantadas segundo metodologia descrita por Porto (1997). Odelineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), com três repetições e utilizadasdez plântulas por repetição. A primeira coleta foi realizada nas plântulas no estádio de V3, o quenestas condições correspondeu a 6 dias após o plantio e a 2 dias após a germinação.  No final doexperimento as plântulas encontravam-se no estádio de V5. Os tratamentos constituíram-se dediferentes períodos: 0 h (sem encharcamento) e 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 h de encharcamentocontínuo, utilizando-se água destilada até a superfície do solo, sempre mantendo a altura dalâmina de água nos copos. Para se obter o extrato protéico, foram utilizados 300 mg de ápices deraiz, macerados em N2 líquido e adiconados de 900 µL de tampão de extração contendo: tampãofosfato de potássio 0,1 M, pH 7.0, EDTA, 100 mM, pH 7.0, DTT, 0,5 M, PMSF, 0,1M, L-ácido2ascórbico, 1mM e 1,5 % de polivinilpolipirrolidona (PVPP).  O teor protéico foi analisado pelométodo de Bradford (1976). Foram utilizados 20 µL do extrato protéico, 200 µL do reagente eleitura da absorbância a 595 nm. A curva padrão foi preparada utilizando-se albumina do serumbovino (BSA). A análise da atividade da APX (EC 1.11.1.11) baseou-se no método de Nakano &Asada (1981), monitorando-se a taxa de oxidação do ascorbato a 290 nm. O meio de reaçãoincubado a 28°C, foi composto de tampão fosfato de potássio 0,1M, pH 7.0, peróxido dehidrogênio (H2O2), 0,03 M, L-ácido ascórbico, 0,1 M, água destilada e 20 µL do extrato protéico.Para cálculo da atividade da APX utilizou-se o coeficiente de extinção de 2,8 mM-1 cm-1.RESULTADOS E DISCUSSÃOPara a atividade da APX, na variedade BR107 e no C1, houve um decréscimo contínuo noperíodo de 0 (zero) a 72 h, com posterior aumento na atividade até 144 h (Figura 1). Para o C8,também houve uma elevação na atividade da APX até 72 h, entretanto, sem diferençasignificativa na atividade após este período (Figura 2).  No ciclo C16 a atividade da APXapresentou aumento linear no período de 0 a 144 h com a exposição das plântulas aoencharcamento contínuo.  Em diferentes estudos envolvendo estresses abióticos, aumento naatividade da APX tem sido verificado em milho sob toxidez de alumínio (Al) (Souza, 2003) e emarroz sob toxidez de chumbo (Verma & Dubey, 2003).  Em contrapartida, decréscimos naatividade da APX foi verificado em estresse por seca em milho (Viana, 2002) e frio em café(Queiroz et al., 1998).  Peixoto et al. (1999) sugerem que, em cultivar de sorgo sensível ao Al, omaior acúmulo de peróxidos e compostos fenólicos é que estaria causando um aumento naatividade da APX.  Entretanto, em nossos dados verifica-se que o C16, ciclo mais avançado deseleção sob encharcamento, apresentou aumento progressivo da atividade da APX, indicando quehouve sucesso do programa de melhoramento genético no ‘Saracura’ para essa característica.Portanto, neste caso, sugere-se que este aumento verificado na atividade da APX, sobencharcamento contínuo, pode estar relacionado à detoxificação através da redução de peróxidos.LITERATURA CITADAASADA, K. Minireview: Ascorbate peroxidase- a hydrogen peroxide-scavenging enzyme inplants. Phisyologia Plantarum, Copenhagen, v. 85, n. 2, p. 235-241, June 1992.ASADA, K. The role of peroxidase do ascorbato and monodehidroascorbate reductase in H2O2scavenging in plants. In: SCANDALIOS, J. G. Oxidative stress and molecular biology ofantioxidant defenses. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997. p. 715-735.BRADFORD, J. M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities ofprotein utiliing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry. V.72, p.248, 1976.CAKMAK, I.; STRBAC, D.; MARSCHNER, H. Activities of hydrogen peroxide- scavengingenzymes in germination wheat seeds. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 44, n. 260, p.127-132, Mar. 1993.NAKANO, Y.; ASADA, K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbato-specific peroxidase inspinach chloroplasts. Plant Cell Physiology, Kyoto, v. 22, n. 5, p. 867-880, 1981.3PEIXOTO, P. H. P.; CAMBRAIA, J.; SANT’ANNA, R.; MOSQUIM, P. R.; MOREIRA. M. A.Aluminum effects on lipid peroxidation and activies of enzymes of oxidative metabolism insorghum. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, Brasília, v. 11, n. 3, p. 137-143, set./dez.1999.PORTO, M.P. Método de seleção de plantas de milho para tolerância ao encharcamento do solo.Pesq. Agrop. Gaúcha, v.3,n.2,p.187-190, 1997.QUEIROZ, C. G. S.; ALONSO, A.; MARES-GUIA, M.; MAGALHÃES, A. C. Chilling-induced changes in membrane fluidity and antioxidant enzyme activities in Coffea arabica L.roots. Biology Plantarum, Prague, v. 41, n. 3, p. 403- 413, 1998.SHIGEOKA, S.; ISHIKAWA, T.; TAMOI, M.;MIYAGAWA, Y.; TAKEDA, T.; YABUTA, Y.;YOSHIMURA, K. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. Journal ofExperimental Botany, Oxford, v. 53, n. 372, p. 1305-1319, May 2002.SOUZA, J. B. Caracterização Fisiológica e Bioquímica de Linhagens de milho visandotolerância ao alumínio. 2003. 70 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) – UniversidadeFederal de Minas Gerais, Belo Horizonte.VERMA, S.; DUBEY, R. S. Lead toxicity peroxidation and alters the activies of antioxidantenzymes in growing rice plants. Plant Science, Clare, v. 164, n. 4, p. 645-655, Apr. 2003.VIANA, M. C. M. Déficit hídrico em genótipos de milho com tolerância diferencial à seca.2002. 75 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) - Universidade Federal de Minas Gerais,Belo Horizonte.4BR107y = 0,0362x2 - 5,9355x + 792,93R2 = 0,82020040060080010000 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade APX(nmol min-1mg-1 proteína)Ciclo 1y = 0,0432x2 - 6,0522x + 771,25R2 = 0,74020040060080010000 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade APX(nmol min-1mg-1 proteína)FIGURA 1.  Efeito do encharcamento contínuo na atividade da peroxidase do ascorbato(APX), em raízes de plântulas da cv. BR107 e do ciclo 1 de seleção do ‘Saracura’. Os valoresde cada cultivar representam a média de 3 repetições ±  erro padrão da análise de variância,p< 0,01.5Ciclo 8y = -0,0423x2 + 6,4397x + 337,72R2 = 0,51020040060080010000 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade APX(nmol min-1mg-1 proteína)Ciclo 16y = -0,0056x2 + 3,0469x + 547,43R2 = 0,84020040060080010000 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade APX(nmol min-1mg-1 proteína)FIGURA 2.  Efeito do encharcamento contínuo na atividade da peroxidase do ascorbato (APX),em raízes de plântulas dos ciclos 8 e 16 de seleção do ‘Saracura’. Os valores de cada cultivarrepresentam a média de 3 repetições ±  erro padrão da análise de variância,  p< 0,01.

Atividade da enzima peroxidase do ascorbato em plântulas de diferentes ciclos de seleção do milho 'Saracura' sob encharcamento contínuo.

1Atividade da Enzima Redutase da Glutationa em Plântulas de Diferentes Ciclos de Seleçãodo Milho ‘ Saracura’ sob Encharcamento ContínuoMarcus J. C. Lopes1, Isabel R. P. Souza2, Paulo C. Magalhães2, Elto E. G. Gama2, José D. Alves3,Marcelo M. Murad 3 e Mina T. Villafort41 Estudante de Doutorado em Agronomia/ Fisiologia Vegetal pela UFLA, Lavras, MG 2 EmbrapaMilho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, e-mail: isabel@cnpms.embrapa.br 3 UFLA, Dep. de Biologia,Setor de Fisiologia Vegetal.4  Estudante de Ciências Biológicas, UFLA.Palavras-chave: hipoxia, seleção massal, ápice radicular, BRS-4154 e BR107.INTRODUÇÃOPesquisadores da Embrapa Milho e Sorgo, por meio do programa de melhoramento, iniciaram em1986, o desenvolvimento de um composto de milho de ampla base genética (mistura balanceadade 36 populações amarelas), denominado BRS-4154 (Saracura), para cultivo em área de várzea(Parentoni et al., 1995). Desde o seu desenvolvimento, a cultivar Saracura continua sendomelhorada por meio da seleção massal estratificada sob encharcamento intermitente e, desdeentão, foram realizados vários trabalhos visando identificar os diversos mecanismos queconferem a essa cultivar tolerância a este tipo de encharcamento. Em planta, dentre as enzimasenvolvidas em reposta a estresses abióticos, o ciclo ascorbato/glutationa representa ummecanismo de detoxificação alternativo e mais eficiente contra o peróxido de hidrogênio (H2O2)gerado no cloroplasto e citosol (Cakmak et al., 1993). O H2O2 é removido em uma série dereações enzimáticas que envolvem, dentre outras enzimas, a redutase da glutationa (GR). Estasreações são conhecidas como via de Halliwell-Asada ou ciclo da ascorbato/glutationa (Polle &Rennenberg, 1993). A glutationa é um tripeptídeo que têm importância na proteção celular(contra a formação de radicais livres), na manutenção do balanço redox da célula, no transportede aminoácidos e participa da regulação alostérica enzimática, sendo utilizada pela GR(Henriques et al., 2001). Em razão de o estresse abiótico estar relacionado à oxidação celular,sugere que a glutationa e a GR possam desempenhar um papel importante nos mecanismos detolerância ao encharcamento em plantas (Smith et al., 1989).  O presente trabalho teve comoobjetivo analisar a atividade da GR na cultivar Saracura, sob encharcamento contínuo.MATERIAL E MÉTODOSO experimento foi conduzido em casa de vegetação, na área experimental da Embrapa Milho eSorgo, Sete Lagoas, MG.  Sementes dos ciclos de seleção do ‘Saracura’: C1, C8 e C16 e datestemunha ‘BR 107’ foram plantadas segundo metodologia descrita por Porto (1997). Odelineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), com três repetições e utilizadasdez plântulas por repetição. A primeira coleta foi realizada nas plântulas no estádio de V3, o quenestas condições correspondeu a 6 dias após o plantio e a 2 dias após a germinação.  No final doexperimento as plântulas encontravam-se no estádio de V5. Os tratamentos constituíram-se dediferentes períodos: 0 h (sem encharcamento) e 8, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 h de encharcamento2contínuo, utilizando-se água destilada até a superfície do solo, sempre mantendo a altura dalâmina de água nos copos. Para se obter o extrato protéico, foram utilizados 300 mg de ápices deraiz, macerados em N2 líquido e adiconados de 900 µL de tampão de extração contendo: tampãofosfato de potássio 0,1 M, pH 7.0, EDTA, 100 mM, pH 7.0, DTT, 0,5 M, PMSF, 0,1M, L-ácidoascórbico, 1mM e 1,5 % de polivinilpolipirrolidona (PVPP).  O teor protéico foi analisado pelométodo de Bradford (1976). Foram utilizados 20 µL do extrato protéico, 200 µL do reagente eleitura da absorbância a 595 nm. A curva padrão foi preparada utilizando-se albumina do serumbovino (BSA). A análise da atividade da GR (EC 1.6.4.2) baseou-se no método de Cakmak etal.(1993), monitorando-se a taxa de oxidação do NADPH, com decréscimo na absorbância a 340nm. O meio de reação incubado a 28°C, era constituído de tampão fosfato de potássio 25 mM, pH7.8, glutationa oxidada (GSSG), 15 mM, NADPH, 7,2 mM e 50 µL do extrato protéico. Paracálculo da atividade da GR, utilizou-se o coeficiente de extinção 6,2 mM-1cm-1.RESULTADOS E DISCUSSÃOVerfica-se na Figura 1 que tanto para a cultivar BR107, como para o C1 a atividade da GRapresentou valores com pequenas variações não significativas ao longo do período deencharcamento contínuo.  Nos ciclos mais avançados de seleção, C8 e C16 (Figura 2), aatividade da GR apresentou a mesma tendência em ambos os casos, com aumento contínuo até 72h, sendo mais expressivo no C16, seguido de decréscimo na atividade até 144 h. Em plantas dearroz sob estresse de chumbo (Verma & Dubey, 2003), foi verificado aumento da atividade daenzima GR, tanto no sistema radicular quanto na parte aérea, quando comparado ao controle. Aatividade dessa enzima foi diretamente proporcional à concentração empregada do metal,sugerindo que este induziu o estresse oxidativo em arroz e que a alta atividade da GR e outrasenzimas antioxidantes representava um importante mecanismo de defesa contra a injúriaocasionada pelo chumbo. Em alguns trabalhos sob estresse abiótico, como: seca (Viana, 2002),alumínio (Souza, 2003) e encharcamento (Yan et al., 1996), embora tenha sido verificadodecréscimo na atividade da GR, este foi muito menor quando se comparava ao controle. Oaumento na atividade da GR até 72 h sob encharcamento contínuo, em ciclos mais avançados, C8e C16, principalmente neste último, provavelmente, estaria contribuindo para a diminuição deespécies reativas de oxigênio. O decréscimo na atividade da GR, após este período, pode estarassociado a um aumento da concentração de compostos antioxidantes e/ou aumento da atividadede outras enzimas antioxidantes.LITERATURA CITADABRADFORD, J. M. A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities ofprotein utiliing the principle of protein-dye binding. Analitical Biochemistry. V.72, p.248, 1976.CAKMAK, I.; STRBAC, D.; MARSCHNER, H. Activities of hydrogen peroxide- scavengingenzymes in germination wheat seeds. Journal of Experimental Botany, Oxford, v. 44, n. 260, p.127-132, Mar. 1993.HENRIQUES, A. P.; DAFRÉ, A. L.; PICADA, J. N.; MARIS, A. F.; SALVADOR, M. Espéciesreativas de oxigênio e avaliação de antioxidantes em sistemas biológicos. In: SERAFINI, L.3A.; BARROS, N. 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Caracterização Fisiológica e Bioquímica de Linhagens de milho visandotolerância ao alumínio. 2003. 70 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) – UniversidadeFederal de Minas Gerais, Belo Horizonte.VERMA, S.; DUBEY, R. S. Lead toxicity peroxidation and alters the activies of antioxidantenzymes in growing rice plants. Plant Science, Clare, v. 164, n. 4, p. 645-655, Apr. 2003.VIANA, M. C. M. Déficit hídrico em genótipos de milho com tolerância diferencial à seca.2002. 75 p. Dissertação (Mestrado em Biologia Vegetal) - Universidade Federal de Minas Gerais,Belo Horizonte.YAN, B.; DAI, Q.; LIU, X.; HUANG, S.; WANG, Z. Flooding-induced membrane damage, lipidoxidation and activated oxygen generation in corn leaves. Plant and Soil, Dordrecht, v. 179, n. 2,p. 261-268, Feb. 1996.4BR107y = 0,0006x2 - 0,1047x + 14,789R2 = 0,61051015202530350 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade GR(nmol min-1mg-1 proteína)Ciclo 1y = 0,0003x2 - 0,0053x + 14,467R2 = 0,55051015202530350 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade GR(nmol min-1mg-1 proteína)FIGURA 1. Efeito do encharcamento contínuo na atividade da redutase da glutationa (GR),em raízes de plântulas da cv. BR107 e do ciclo 1 de seleção do ‘Saracura’. Os valores decada cultivar representam a média de 3 repetições ±  erro padrão da análise de variância,p< 0,01.5Ciclo 8y = -0,0012x2 + 0,1644x + 15,082R2 = 0,68051015202530350 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamentoAtividade GR(nmol min-1mg-1 proteína)Ciclo 16y = -0,0018x2 + 0,2733x + 17,502R2 = 0,64051015202530350 24 48 72 96 120 144Tempo de encharcamento (h)Atividade GR(nmol min-1mg-1 proteína)FIGURA 2. Efeito do encharcamento contínuo na atividade da redutase da glutationa (GR),em raízes de plântulas dos ciclos 8 e 16 de seleção do ‘Saracura’. Os valores de cadacultivar representam a média de 3 repetições ±  erro padrão da análise de variância,p< 0,01.

Atividade da enzima redutase da glutationa em plântulas de diferentes ciclos de seleção do milho 'Saracura' sob encharcamento contínuo.

http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/bitstream/doc/490083/1/Enzimaperoxidase.pdf

Atividade da enzima redutase da glutationa em plântulas de diferentes ciclos de seleção do milho 'Saracura' sob encharcamento contínuo.

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