ALVES, C. R.

CARVALHO, J. B. de

DUTRA, R. F.

FURTADO, R. F.

RONDINA, D.

SILVA, V. P. A. da

Portuguese

CARVALHO, J. B. de.

SILVA, V. P. A. da.

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Utilização de biossensor de eletrodo de ouro modificado para determinação de ricina e ricinus aglutinina em farelo de mamona.

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IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 305 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310.   UTILIZAÇÃO DE BIOSSENSOR DE ELETRODO DE OURO MODIFICADO PARA DETERMINAÇÃO DE RICINA E RICINUS AGLUTININA EM FARELO DE MAMONA1 João Bosco de CarvalhoI; Vitor Paulo Andrade da SilvaI.; Roselayne Ferro FurtadoIII; Carlucio Roberto AlvesI; Davide RondinaII;Rosa Fireman DutraIV;  IDepartamento de Química, Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana, 1700, 60740-000,Fortaleza – CE, Brasil,  bosco_kashi@hotmail.com ; IIDepartamento de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana, 1700, 60740-000,Fortaleza – CE, Brasil, davide@pq.cnpq.br ; IIIEmbrapa Agroindústria Tropical, Rua Dr. Sara Mesquita, 2270, Planalto Pici, 60511-110, roselayne@cnpat.embrapa.br ; IVDepartamento de ciências biológicas, UPE, Recife - PE  RESUMO – O presente trabalho visa o desenvolvimento de um biossensor de eletrodo de ouro modificado para determinação de ricina (RCA 60) e ricinus aglutinina RCA (120). Verificou-se que o biossensor foi satisfatório na detecção de RCA 60 e RCA 120, tanto em solução tampão quanto em farelo de mamona. O dispositivo mostrou-se adequado para averiguação da qualidade do farelo de mamona quanto a presença das lectinas. O Limite de detecção encontrado foi de 4 ppm e o Limite de Quantificação foi de 14 ppm. Palavras-chave- Biossensor, RCA 60, RCA 120, resíduo  INTRODUÇÃO O potencial de uso da torta de mamona, co- produto gerado em grande quantidade no processo de produção do biodiesel, na forma de ração e tem ganhado incentivos visando a agregação de valor. Contudo, dentre outras proteínas encontram-se na torta de mamona: a ricina (RCA 60) e a ricinus aglutinina (RCA 120), proteínas nocivas a animais. A viabilização da torta de mamona como ração é feita após processo de destoxificação por diferentes métodos químicos e físico-químicos.  Após os processos de destoxificação, a ração deve ser submetida a análise quanto a presença das lectinas ricina e ricinus aglutinina. Métodos analíticos de detecção podem ser empregados para reconhecer tais lectinas presentes na torta de mamona e assim utilizá-la de forma segura.                                                1 Embrapa, CNPq, Funcap, UECE IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 306 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310. .O presente trabalho foi dedicado à detecção das lecticas ricina e ricinus aglutinina em torta de mamona para futuro uso agro-industrial, utilizando biossensor eletroquímico. Neste sentido, primeiramente, purificamos estas duas lectinas e posteriormente, estudamos a resposta do biossensor desenvolvido. Ricina (RCA 60) e Ricinus aglutinina (RCA 120) A ricina é a proteína tóxica presente em maior quantidade na torta de mamona e pequena quantidade desta proteína pode levar animais e ser humano a óbito em pouco tempo após a sua ingestão. A ricina é uma proteína inativadora de ribossomos (RIPs) do tipo II, heterodimérica, com a enzima inibidora de ribossomo (~32 kDa, cadeia A ou RTA) ligada por ponte dissulfeto a uma lectina galactose (~34 kDa, cadeia B ou RTB) (Lord et al., 1994). As doses letais de ricina para animais é em torno de 1 mg/kg (1 ppm) (Eiklid et al., 1980). No intuito de garantir o uso seguro da torta de mamona como ração é recomendado análise de amostras quanto a presença de ricina e ricinus aglutinina a cada processo de destoxificação. A aglutinina RCA 120 é um tetrâmero composto por duas cadeias A e B. As cadeias polipeptídicas de RCA 60 e RCA 120 são estruturalmente relacionadas e apresentam 93% e 84% de homologia entre as seqüências primárias das cadeias A e B, respectivamente. (Turton et al., 2004). Essa lectina possui alta atividade hemaglutinante. Biossensor Desde a década de 70 estuda-se a possibilidade de combinação de amperometria com a alta seletividade de reações catalizadas por enzimas com o intuito de determinar agentes biológicos e bioquímicos, dando origem a vários tipos de biossensores. O funcionamento destes aparelhos se dá através do contato da amostra de interesse com uma enzima ou anticorpo imobilizado provocando uma reação catalítica proporcional a quantidade do analito de interesse.(Durst et al.,1969). Dentre as vantagens dos biossensores estão a alta seletividade e especificidade das interações, baixo custo, amplo aproveitamento seja este laboratorial ou industrial e fácil utilização.  METODOLOGIA Extração e purificação das lectinas As sementes de mamona foram descascadas, trituradas e prensadas para a retirada do óleo. A fim de eliminar o óleo residual, a amostra foi colocada em hexano por 16 horas, em recipiente fechado IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 307 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310. e no dia seguinte, o hexano foi retirado e a amostra foi deixada em capela de exaustão para eliminação total do solvente. A amostra foi diluída em solução de NaCl 0,15M na proporção de 1:8, e foi deixada sob agitação por 30 minutos e centrifugada a 4 ºC, 33.000 x g, por 20 minutos para separação do sobrenadante. O sobrenadante foi conduzido a matriz de goma de guar e deixada em repouso por uma hora. A eluição das lectinas de interesse foi feita com 0,1M de glicina e NaCl 0,15M pH 2,6 em um fluxo de eluição de, aproximadamente, 0,5 mL/min. O material eluído foram dialisados contra água e, posteriormente, liofilizados e armazenados à temperatura ambiente ou em freezer (-20 ºC), dentro de frascos bem vedados para evitar a entrada de umidade. Obtenção do farelo de mamona As lectinas foram purificadas utilizando cromatografia de afinidade de goma de guar segundo metodologia de (Appukutan et al., 1977). O farelo de mamona foi adquirido junto a Usina Bom - Brasil Oleo de Mamona Ltda. O tratamento de destoxicação do farelo mamona foi realizado com CaO conforme metodologia de Oliveira, (2008). Amostras do farelo de mamona in natura e destoxificado foram caracterizados por eletroforese SDS-Page e testes de hemaglutinaçao no intuito de comprovar a eficiência do tratamento químico (dados não mostrados). Produção e purificação dos anticorpos policlonais Anticorpos anti- RCA 60 e RCA 120 foram produzidos em coelhos da raça Nova Zelândia com seis meses de idade e purificados posteriormente conforme metodologia de Furtado (2008). Imobilização e estudo eletroquímico  Eletrodo de ouro modificado foi imerso em solução de RCA 60 e RCA 120 por 1 hora e seguidamente foi feito bloqueio do sistema eletroquímico com BSA 3% por uma hora. Ao final, o eletrodo foi deixado em repouso em solução de anticorpo anti- RCA 60 e RCA 120 conjugado a peroxidase por duas horas. Após cada etapa, o eletrodo foi lavado com água deionizada a fim de retirar os não- ligantes. Determinação de RCA 60 e RCA 120 foi medida a partir da intensidade de corrente correspondente a redução eletroquímica da benzonquinona. Este composto é formado pela catalise da peroxidase em solução de H2O2 na presença de hidroquinona como mediador. Isso foi realizado por imergir o eletrodo de trabalho em solução tampão fosfato em pH 7,0 e aplicar uma voltagem de polarizaçao de -100 mV para o eletrodo de platina contra um Ag/AgCl (Sat. KCl). Todas as medidas foram conduzidas a temperatura ambiente em solução purgadas com N2 por 15 minutos. As medidas IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 308 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310. na presença das lectinas foram sempre comparadas as sem lectinas para o cálculo da intensidade de corrente final.  RESULTADOS E DISCUSSÃO Com base nos dados obtidos através do presente estudo e na curva de calibração (fig.1), determinou-se o limite detecção (LD) (mais baixa concentração de do analito em questão que pode ser determinada com certo grau de confiabilidade.) e o limite de quantificação (LQ) (mais baixa concentração de do analito em questão que pode ser determinada de forma quantitativa com precisão e exatidão.). O LD foi calculado multiplicando por três o desvio padrão das medidas do branco e dividido pela inclinação da curva analítica. O LQ foi calculado multiplicando por dez o desvio padrão das medidas do branco e dividido pela inclinação da curva analítica. O LD foi de 4 ppm e o LQ = 14 ppm. A resposta do biossensor em farelo não detoxificado e destoxificado foi distinta e maior alteração de corrente elétrica foi verificada para o farelo in natura, caracterizando assim uma resposta positiva do biosensor frente a detecção das lectinas (fig. 2).  CONCLUSÕES Concluímos que o presente trabalho mostrou-se satisfatório na detecção de RCA 60 e RCA 120, tanto em solução tampão quanto em farelo de mamona. O dispositivo pode ser utilizado para averiguação da qualidade do farelo de mamona quanto a presença das lectinas. Novos estudos estão sendo realizados para melhorar os limites de detecção e quantificação, bem como o desenvolvimento de eletrodos descartáveis.  REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APPUKUTTAN, P. S., SUROLLA, A. and BACHHAWAT, B. K. Isolation of two galactose-binding proteins from Ricinus communis by affinity chromatography. Indian J. Biochem. Biophys. v. 14, n.4, p.382-384. 1977. DURST, R. A. Ion selective electrodes.Special publication. P.314. 1969. IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 309 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310. EIKLID K., OLSNES S., PIHL A. Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol of HeL a cells. Exp. Cell. Res. v.126, p. 321–326. 1980. FURTADO, R.F.; GUEDES, M.I.F.G; ALVES,C.R.; MOREIRA, A.C.O.M. Produção de anticorpos policlonais anti-ricina: metodologia científica. Fortaleza : Embrapa Agroindústria Tropical, 2008. 17 p. (Embrapa Agroindústria Tropical. Documentos, 116). LORD, J.M.; ROBERTS, L.M.; ROBERTUS, J.D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. The FASEB journal. v. 8, p.201-208. 1994. OLIVEIRA, I. R.W.Z. ;Vieira, I.C. 2006. Construção e aplicação de biossensores usando Diferentes procedimentos de imobilização da peroxidase de vegetal em matriz de quitosana. Quím. Nova. v. 29,p. 932-939. TURTON, K.; Natesh, R.; Thiyagarajan, N.; Chaddock, J. A.; Acharya, K. R.; Glycobiology, v. 14, p. 923. 2004.    IV Congresso Brasileiro de Mamona e  I Simpósio Internacional de Oleaginosas Energéticas, João Pessoa, PB – 2010 Página | 310 CONGRESSO BRASILEIRO DE MAMONA, 4 & SIMPÓSIO INTERNACIONAL DE OLEAGINOSAS ENERGÉTICAS, 1, 2010, João Pessoa. Inclusão Social e Energia: Anais... Campina grande: Embrapa Algodão, 2010. p. 305-310.                                                                                                                                                                                                                                                                                          0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00.00-0.05-0.10-0.15-0.20-0.25-0.30  I/ AConcentraçao RCA 60 e RCA 120 (g L-1) Figura 1- Curva analítica típica obtida para o biossensor em diferentes concentrações de RCA 60 e RCA 120 em tampão fosfato pH 7 em 35 µmol L- de hidroquinona e 60 µmol H202.Potencial aplicado -110 mV (VS. ECS).                                                                                                                                                                                                                                                                                          0.0-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2-1.4Desnaturada                       Não desnaturada  corrente,AAmostra do farelo de mamona Figura 2- Determinação de RCA 60 e RCA 120 em amostras de farelo de mamona dstoxificado e não destoxificado em tampão fosfato pH 7 e 35 µmol  de hidroquinona e 60 µmol H202. velocidade= 100 mVs-1. Potencial aplicado -100 mV (VS. ECS). N=3.  

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