Optimization of human hepatocyte cultures for citotoxicity studies

Abstract

Los cultivos de hepatocitos entregan un valioso acercamiento al estudio de las funciones metabólicas específicas del hígado, evaluación de citotoxicidad. No existen líneas humanas inmortales con función normal. La inmortalización de hepatocitos humanos con el método UCHT1(medio de cultivo condicionado por células tumorales de tiroides) permitirá prolongar la sobrevida y función de estos, siendo útil para evaluar funcionalidad y citotoxicidad. Objetivo: Optimizar el cultivo de hepatocitos humanos. Metodología: En cultivos primarios de hepatocitos humanos, se agregó medio UCHT1 cultivando en superficies de colágeno, polilisina, gelatina y matrigel. Como control positivo, se utilizó línea Gherschenson (GER) para evaluar curva de crecimiento y producción de Glucógeno (PAS). Se evaluó citotoxicidad (LIVE/DEAD) en hepatocitos GER expuestos a Metotrexato (10, 100 y 1000 mM) a 24, 48 y 72 hrs. Resultados: Se realizó 3 cultivos primarios. Fue efectiva la utilización de Polilisina y Colágeno. Duración 8 meses. No se ha realizado la curva de crecimiento, ni evaluación de funcionalidad en hepatocitos humanos. La línea GER tiene un crecimiento exponencial (tiempo duplicación: 36 hrs). Se observó producción de glucógeno en condiciones de diferenciación hasta 120 hrs. La citotoxicidad por Metotrexato tiene una curva dosis dependiente, significativa en todas las concentraciones (p<0,001) (CL50 a 1000 mM a 24 hrs). Conclusiones: Se logró establecer una línea primaria de hepatocitos humanos. La polilisina y el colágeno han optimizado el establecimiento de cultivos primarios. El método PAS permitió evaluar producción de glucógeno (diferenciación). Los valores de citotoxicidad demostraron un efecto dosis dependiente en las condiciones experimentales. Logrando estandarizar el método para evaluación futura de líneas celulares humanas