Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) was used to characterise 41 Staphylococcus aureus isolates taken from Hospital San Juan de Dios (Bogotá) patients and personnel at the Intensive Care Unit (ICU), from September 1998 to September 1999. The genetic relationships between isolates, as well as resistance profile influence, biotype and compilation time/date, were established. The experimental evidence suggests that the population structure corre-sponds to the clonal model described for Staphylococcus aureus populations, reflecting the prevalence of a small number of clones during the collection period.Se caracterizaron 41 aislamientos se Staphylococcus aureus tomados a pacientes y personal de la unidad de cuidados intensivos (UCI) del Hospital San Juan de Dios, en el periodo comprendido entre septiembre de 1998 y septiembre de 1999 por medio del método de caracterización de Electroforesis de Enzimas Multilocus(MLEE). Se establecieron las relaciones genéticas entre los individuos, así como influencia del perfil de resistencia, el biotipo y el periodo de recolección. La evidencia experimental sugirió que la estructura de la población analizada encaja en el modelo clonal descrito previamente para las poblaciones de Staphylococcus aureus, coincidiendo con la prevalencia de un pequeño número de clones durante el periodo de recolección

Agudelo Calderón, Carlos Alberto

Mantilla, José Ramón

Suárez, Zulma

Valenzuela, Emilia María

Revista Colombiana de Biotecnología

Spanish

Se caracterizaron 41 aislamientos se Staphylococcus aureus tomados a pacientes y personal de la unidad de cuidados intensivos (UCI) del Hospital San Juan de Dios, en el periodo comprendido entre septiembre de 1998 y septiembre de 1999 por medio del método de caracterización de Electroforesis de Enzimas Multilocus(MLEE). Se establecieron las relaciones genéticas entre los individuos, así como influencia del perfil de resistencia, el biotipo y el periodo de recolección. La evidencia experimental sugirió que la estructura de la población analizada encaja en el modelo clonal descrito previamente para las poblaciones de Staphylococcus aureus, coincidiendo con la prevalencia de un pequeño número de clones durante el periodo de recolección

Zulma Suárez

Emilia María Valenzuela

José Ramón Mantilla

Carlos Agudelo

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Caracterización molecular de Staphylococcus aureus de origen nosocomial por Electroforesis de Enzimas Multilocus (MLEE)

LAReferencia - Red Federada de Repositorios Institucionales de Publicaciones Científicas Latinoamericanas

Caracterización molecular de Staphylococcus aureus de origen nosocomial por Electroforesis de Enzimas Multilocus (MLEE) Molecular characterization of Staphylococcus aureus from nosocomial sources by Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) Zulma Suárez *, Emilia María Valenzuela *, José Ramón Mantilla *, Carlos Agudelo** RESUMEN Se caracterizaron 41 aislamientos se Staphylococcus aureus tomados a pacientes y personal de la unidad de cuidados intensivos (UCI) del Hospital San Juan de Dios, en el periodo comprendido entre septiembre de 1998 y septiembre de 1999 por medio del método de caracterización de Electroforesis de Enzimas Multilocus(MLEE). Se establecieron las relaciones genéticas entre los individuos, así como influencia del perfil de resistencia, el biotipo y el periodo de recolección. La evidencia experimental sugirió que la estructura de la población analizada encaja en el modelo clonal descrito previamente para las poblaciones de Staphylococcus aureus, coincidiendo con la prevalencia de un pequeño número de clones durante el periodo de recolección. Palabras clave: Electroforesis de enzimas multilocus (MLEE), Staphylococcus aureus, Enfermedades nosocomiales. ABSTRACT Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE) was used to characterise 41 Staphylococcus aureus isolates taken from Hospital San Juan de Dios (Bogotá) patients and personnel at the Intensive Care Unit (ICU), from September 1998 to September 1999. The genetic relationships between isolates, as well as resistance profile influence, biotype and compilation time/date, were established. The experimental evidence suggests that the population structure corre-sponds to the clonal model described for Staphylococcus aureus populations, reflecting the prevalence of a small number of clones during the collection period. Key words: Multilocus enzyme electrophoresis (MLEE), Staphylococcus aureus, nosocomial diseases INTRODUCCIÓN Los trabajos realizados en torno a Staphylo-coccus aureus Meticilino-Resistentes (MRSA) residentes en el ambiente hospitalario son numerosos. Sin embargo, pocos se ajustan a la realidad de hospitales y clínicas colombia-nas, de modo que no se dispone de estudios profundos que describan la situación real y con ello, permitan proponer alternativas. El objeto de este estudio fue estimar las relaciones existentes entre 41 aislamientos de Staphylococcus aureus tomados a pacientes y personal de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) del Hospital San Juan de Dios, en el pe-riodo comprendido entre septiembre de 1998 y septiembre de 1999 por medio del método de tipificación Electroforesis de Enzimas Multilocus (MLEE), y deducir las asociacio-nes entre las relaciones detectadas por la téc-   *   Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional De Colombia. Ciudad Universitaria. Edificio Manuel Ancjzar. A.A. 14490. Fax 3165415 Teléfono 3165000 extensión 16959. e- mail: zulsua@ciencias.unal.edu.co                                                                          ** Instituto de Salud en el Trópico. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Colombia. Teléfono 3165000 extensión 15036 Recibido: julio 26 de 2002; aceptado: diciembre 20 de 200258 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE S. Aureus DE ORIGEN NOSOCOMIAL POR ELECTROFORESIS DE MLEE nica y la información obtenida entre la historia clí-nica, como por ejemplo la terapia antibiótica usa-da y el periodo de permanencia en la sala. METODOLOGÍA Población analizada La población total estuvo conformada por 41 mues-tras de Staphylococcus aureus, 27 de las cuales fueron aisladas de pacientes hospitalizados en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital San Juan de Dios, Bogotá D.C. Colombia entre sep-tiembre de 1998 y septiembre de 1999 (subpobla-ción de Pacientes). Simultáneamente, se tomaron 54 muestras al personal de la sala, identificando 12 de éstas como Staphylococcus aureus (subpo-blación de personal). Se incluyeron además una cepa patrón de S. aureus ATCC 25932 y un Sfa-phylococcus xilosus recolectado en la UCI durante el mismo periodo. Todas las muestras fueron identificadas con el sistema API ID 32 system para Staphylococcus y Micrococcus (BioMérieux, Mar-cy l'Etoile, Francia), el cual asigna un numero de biotipo a cada aislamiento de acuerdo con un set de pruebas bioquímicas Antibiogramas Todas las cepas fueron sometidas a pruebas de susceptibilidad de antibióticos mediante el Kit bioMerieux's ATB Staph system (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia). Electroforesis de Enzimas Multilocus (MLEE) Cada aislamiento fue crecido en 40 ml_ de infu-sión cerebro-corazón (BHI Difco USA) durante toda la noche a 37QC en un agitador orbital (250 rpm) y recogido por centrifugación a 6000 g por 30 mi-nutos. Posteriormente, las proteínas fueron extraí-das y sometidas a electroforesis bajo condiciones previamente establecidas para el laboratorio (Bustamante 1999). Se determinó la actividad enzimática de 11 enzimas: Adenilato kinasa (ADK 2.7.4.3), Alanina deshidrogenase (ALD 4.1.2.13), nucleósido fosforilasa (NSP 2.4.2.1), NADH diaforasa (NADH DÍA 1.8.4.1), NADPH diaforasa (NADH DÍA 1.6.99.1), lactato deshidrogenasa (LDH 1.1.1.27), enzima málica (ME 1.1.1.40), fosfoglucosa isomerasa (PGI 5.3.1.9), glutámico pirúvico transaminasa (GPT 2.6.1.2), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6P 1.1.1.49), y alcohol deshidrogenasa (ADH 1.1.1.1), de acuerdo con la técnica descrita previamente (Selander etal. 1986) Las variantes de movilidad de cada enzima (electromorfos) se numeraron en orden decrecien-te de migración anodal y se igualaron a alelos al correspondiente locus estructural. El desplaza-miento de los electromorfos fue expresado en tér-minos de la movilidad relativa con respecto al azul de bromofenol. La ausencia de actividad enzimá-tica fue atribuida a un alelo nulo y se asignó un valor de cero. Cada aislamiento fue caracteriza-do a partir de la combinación de los alelos de los 11 loci enzimáticos, lo cual se designó como tipo electroforético. Análisis estadístico Se utilizaron los programas elaborados por TS Whittam para analizar los datos de los TE y para calcular las diversidades genéticas y genotípicas como resultado de sus trabajos en MLEE en pobla-ciones de Escherichia co//(Whittam 1983). La diver-sidad genética por locus se calculó como se descri-be previamente (Selander etal. 1986). Se construyó una matriz de distancia basada en las diferencias existentes entre pares de TE. Los alelos nulos no fueron tenidos en cuenta para las comparaciones. La matriz de distancia permitió obtener un dendograma usando como estrategia de agrupa-miento el método UPGMA (Figura 1). La estructura de la población fue establecida calculando el índice de asociación (IA) descrito por Maynard (1993) como medida de la asociación no aleatoria entre loci. IA se calculó a partir de la matriz del número de diferencias entre aislamientos o en-tre TE, a nivel de la población total o de las subpo-blaciones de pacientes y personal, y de los dos prin-cipales grupos de biotipo. También se hizo la distri-bución de frecuencias para el número de diferen-cias, tanto entre TE como entre aislamientos, como indicador de alta varianza. (Figura 2) La técnica se evaluó en cuanto a su capacidad de tipificación y su poder de discriminación, usando el índice de discriminación (D) reportado por Hunter y Gastón (1988).          59  REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA   Vol IV   N° 2    Dic. 2002    58 - 63 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Biotipos y antibiogramas Se identificaron 9 biotipos, pero fueron predominan-tes los biotipos 1 y 2. Se determinó que todas las cepas fueron sensibles a teicoplanina, trimetropin-sulfa y vancomicina, mientras que presentaron re-sistencia a eritromicina, clindamicina, pefloxacina y ciprofloxacina. Este hecho sugiere preliminarmente la presencia de un antecesor común con este perfil de resistencia dentro de la población analizada. La combinación de los resultados de resistencia a otros antibióticos (penicilina, cefalotin, ampicilina-sulbactam, gentamicina, netilmeticilina, tetraciclina, furantoína y rifampicina) permitió generar 19 patro-nes de resistencia antibiótica (Datos no mostrados) (Suárez 2000) TE y diversidad genética Todas las enzimas analizadas fueron polimórficas. El número de alelos varió entre 2 y 7, para las enzi-mas G6PD y NADH DÍA respectivamente. Con este resultado se obtuvo un promedio de 4.5 alelos por locus. La diversidad genética promedio para la po-blación fue de 0.506 (Tabla 1). La diversidad genotípica calculada para la población total fue de 0.948. La diversidad genotípica calculada sobre las  subpoblaciones fue de 0.894 y 0.913 para personal y pacientes, respectivamente. (Datos no mostrados). Estos valores resultan altos al compararlos con otros valores obtenidos en estudios previos de S. aureus, sin embargo este comportamiento puede estar re-velando variabilidad genética, hecho que se ha re-lacionado con un impacto notable en las propieda-des biológicas de relevancia medica.(Tibayrenc 1996). De otro lado, una alta diversidad genotípica como la observada podría revelar la coexistencia de clones de abundancia similar (Fuste et al. 1996; Go et al. 1996) La combinación de electromorfos permitió obte-ner 30 tipos electroforéticos (TE). El promedio de aislamientos por TE fue de 1.36. La frecuencia más alta fue para el TE 4, el cual caracterizó 6 aislamien-tos. 24 TE representaron un solo aislamiento, sin embargo debe resaltarse que las poblaciones de personal y pacientes no tuvieron TE en común. En siete casos diferentes, se obtuvieron dos aislamien-tos del mismo paciente, pero en sólo uno de ellos los dos aislamientos fueron representados por el mis-mo TE, y los casos restantes mostraron diferentes TE e incluso diferentes patrones de resistencia Estructura de la población Los valores obtenidos para el índice de asociación a todos los niveles (Tabla 2) sugieren que la estruc-tura de la población encaja en el modelo clonal des-crito por Maynard Smith (Maynard 1993), siendo esto coherente con la tendencia bimodal presentada por la distribución de frecuencias tanto para TE como para aislamientos (Figura 2). 60  CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE S. Aureus DE ORIGEN NOSOCOMIAL POR ELECTROFORESIS DE MLEE Estos dos indicadores han sido referenciados pre-viamente para la estimación de la estructura de po-blaciones de otros patógenos multirresistentes (Fuste et al. 1996; Go et al. 1996). Las poblaciones son clónales cuando la recombinación no es frecuente y el desequilibrio de ligamiento es alto. En este caso, los valores de IA son estadísticamente diferentes de O a todos los niveles del análisis. En contraste, cuan-do la recombinación es frecuente los valores de lA no difieren estadísticamente de 0, lo cual sugiere que la población es sexual o panmítica. En los valores obtenidos para IA se observa una disminución al contemplar los grupos obtenidos por el dendograma, lo cual podría sugerir una estructu-ra epidémica, sin embargo esta consideración se in-valida ya que al examinar los grupos o cluster se remueve la mayor parte del desequilibrio automáti-camente y por esto no puede detectarse al calcular IA Además, la baja asociación a este nivel puede jus-tificarse por la presencia de un TE más común que los demás (TE 4) que difiera de ellos en uno o dos loci. El hecho de que los grupos existan porque la recombinación no los ha roto es evidencia de una estructura cercanamente clonal para la población completa. Este hecho sería acorde con lo previamente establecido para la diversidad genotípica. Todo lo anterior es válido para sugerir una estructura pobla-cional en la que algunos clones emergieron como resistencia a una presión selectiva, tal como la resis-tencia antibiótica, razón por la cual conservan resis-tencia a un grupo de antibióticos. En el dendograma obtenido (Figura 1) se obser-va la formación 5 grupos principales a una distancia genética de 0.22, comportamiento similar al reporta-do en estudios previos.(Musser et al. 1992; Fitzgerald et al. 1997) Este agrupamiento coincide con la subpoblación de origen, ya que el 75% de los indi-viduos de la población de personal fueron incluidos en el grupo A y el 78% de los individuos de la subpoblación de pacientes fueron incluidos en el gru-po B. Igualmente se observó que el aislamiento de S. xilosus incluido se ubicó en la rama más distante del dendograma, representado por el TE 1. La forma del dendograma ha sido utilizada para elucidar la estructura de la población, dado que los dendogramas que tengan ramificaciones profundas (semejantes a un árbol) podrían ser identificados con poblaciones clónales, mientras que aquellos con mu-chas ramificaciones no profundas (como un cepillo)  Figura 1. Dendograma obtenido a partir de la matriz de dife-rencias entre TE, usando como estrategia de agrupamiento UPGMA. En negrilla los TE de la población de personal, el TE 1 ubicado en la rama más alejada corresponde a S. xilosus. A una distancia de 0.22 se observan los grupos demarcados por las letras mayúsculas.  Figura 2. Distribución de frecuencias para el número de dife-rencias. Las barras negras representan las diferencias entre TE y las barras blancas entre aislamientos.          61  REVISTA COLOMBIANA DE BIOTECNOLOGÍA   Vol IV   N° 2    Dic. 2002     58 - 63 pueden corresponder a poblaciones sexuales (Fuste et al. 1996; Selander et al. 1994; Wise et al. 1995). En el caso bajo estudio, el dendograma presenta una ramificación a 0.34 pero se asemeja a un cepillo si sólo se consideran los grupos A y B en la unión que aparece a 0.22. Estos resultados, además de los obtenidos para el índice de asociación, soportan la hipótesis de que la población examinada tiene una estructura clonal. Un comportamiento similar al ob-servado ha sido reportado en estudios previos para Staphylococcus aureus y, Haemophilus influenzas (Fuste et al. 1996; Musser et al. 1992; Selander et al. 1985) La razón principal para determinar la estructura de la población fue saber si los clones existentes pro-venían de una antecesor común. Los datos obteni-dos en este trabajo sugieren que dada la presencia de resistencias comunes en los grupos A y B, y la detección de nuevas resistencias en los individuos sometidos a terapia es probable que un clon con el perfil de resistencia conservado circulara dentro de la sala, hecho que le permitió colonizar a los pacien-tes y con ello adquirir resistencia a los antibióticos de la terapia de cada paciente, como resultado de la presión antibiótica. Dado que los aislamientos carac-terizados por el TE 4 fueron colectados en diferen-tes momentos del periodo de tiempo contemplado, se puede sugerir que dicho clon tiene estabilidad espacio temporal. Análisis de la técnica La capacidad de tipificación para MLEE fue del 100%, resultado que corresponde a una capacidad de tipi-ficación ideal para cualquier técnica de tipificación y que sugiere que la detección de polimorfismos por MLEE representa una característica estable para la tipificación. Los resultados del índice de discrimina-ción otorgan el mayor poder de discriminación a la caracterización por MLEE (97.35%), con respecto a la caracterización por biotipo (77.19%) o antibiogra-mas (90.51%). Este resultado revela la importancia de implementar técnicas de tipificación que aumen-ten la información obtenida en la práctica médica de rutina, la cual se basa esencialmente en el uso del biotipo y el perfil de resistencia. El desarrollo de este trabajo permitió establecer las relaciones genéticas existentes entre una pobla-ción de Staphylococcus aureus obtenidos en el ám-bito hospitalario. Igualmente, fue posible proponer una estructura clonal para población bajo estudio dada la presencia de perfiles de resistencia comu-nes a la mayoría de la población, usando una técni-ca que demostró tener una capacidad de tipificación y poder de discriminación aceptables para los objeti-vos del trabajo. AGRADECIMIENTOS Este Trabajo fue desarrollado con Financiación del Posgrado Interfacultades de Microbiología. Los au-tores agradecen la colaboración del Dr. T. Whittam de la Universidad Estatal de Pensilvania y de Diego Riaño y Silvia Bustamante del Instituto de Biotecno-logía en el análisis de los datos. BIBLIOGRAFÍA Bustamante, S.1999. Caracterización por Electrofo-resis de Enzimas Multilocus de Vibrio cholerae. Trabajo de grado para optar al título de Biólo-ga. Universidad Nacional de Colombia. Fitzgerald J.R., Meaney W.J., Hartigan P.J., Smyth C.J., Kapur V.1997. Fine-Structure molecular epidemiological analysis of Staphylococcus aureus recovered from cows. Epidemiol Infecí. 119:261-269. Fuste M.C., Pineda A., Palomar J., Viñas M., Loren J.G. 1996. Clonality of multidrug-resistant non-typeable strains of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbio!. 34:2760-2765. Go M., Kapur V., Graham D., Musser J. 1996. 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Molecular characterization of staphylococcus aureus from nosocomial sources by multilocus enzyme electrophoresis (mlee)

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