Dissertação de mestrado em Segurança Alimentar, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraO Alecrim (Rosmarinus officinalis L.) é uma espécie aromática medicinal pertencente à
família das Lamiaceae largamente reconhecida pela sua utilização em culinária e nas indústrias
farmacêutica, alimentar e cosmética. Esta é uma planta perene adaptando-se adequadamente
ao clima predominantemente Mediterrâneo de Portugal, sendo caraterizada por possuir
teores elevados de óleos essenciais. Os óleos essenciais são compostos de baixo peso
molecular, capazes de atravessarem a barreira hemato-encefálica, normalmente isentos de
toxicidade e que apresentam diversas propriedades biológicas, como por exemplo,
propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e antimicrobianas.
Doenças causadas por microorganismos infeciosos, nomeadamente fungos e bactérias
têm representado um sério risco para as populações em todo o mundo, principalmente
devido ao fato de desenvolverem resistências aos antimicrobianos sintéticos. Por outro lado,
a oxidação assim como a contaminação microbiana têm sido causas relevantes de
deterioração dos alimentos, originando grandes perdas económicas e problemas de saúde
pública. Desta forma, a procura de agentes antimicrobianos naturais tem suscitado grande
interesse na comunidade médica e científica.
O stresse oxidativo associado a inflamação crónica foi recentemente reconhecido
como um fator chave para as alterações fisiopatológicas observadas em uma ampla gama de
doenças, tais como a disfunção cerebral, cancro, doenças cardiovasculares, doenças
hepáticas e o declínio do sistema imunológico. Deste modo, moléculas detentoras de
propriedades anti-inflamatorias e simultaneamente antioxidantes apresentam elevado
potencial terapêutico no tratamento destas patologias.
Neste contexto, no presente trabalho pretende-se avaliar as potencialidades biológicas
do óleo essencial de R. Officinalis oriundo de Portugal, sendo possível estudar as suas
atividades antifúngicas, contra várias estirpes de leveduras e fungos filamentosos patogénicos
para o homem e outros animais, incluindo a inibição do tubo germinativo em Candida
albicans, um importante fator de virulência. Também a atividade antibacteriana contra
estirpes de bactérias patogénicas de origem alimentar foi avaliada, tendo por base a mínima
concentração inibitória (MIC) e a mínima concentração letal (MLC).
O potencial anti-inflamatório do óleo essencial de R. officinalis foi também avaliado num
modelo in vitro representativo da inflamação periférica, utilizando a linha celular de
macrófagos (Raw 264.7) estimulada com o agonista do recetor Toll-like 4, o
lipopolissacarídeo (LPS). Na presença de produtos bacterianos, como o LPS, os macrófagos
produzem mediadores pro-inflamatórios, nomeadamente o óxido nítrico (NO), responsável
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pela amplificação da resposta inflamatória. Concominatemente testou-se a citotoxidade do
óleo essencial na mesma linha celular na presença de LPS, bem como a sua citotoxicidade em
diversas linhas celulares humanas do epitélio alveolar (A549), queratinócitos (HaCaT),
hepatócitos (Hep G2) e intestinais (Caco-2), com o objetivo de identificar concentrações do
óleo essencial bioativas e isentas de toxicidade.
Para o presente trabalho avaliou-se ainda a atividade antioxidante do óleo essencial
pelo método de substância reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS), na presença e na
ausência de um indutor de peroxidação lipídica (ABAP).
Os ensaios da avaliação da atividade antifúngica mostraram que o Cryptococcus
neoformans foi a levedura que apresentou maior sensibilidade ao óleo essencial com valores
de MIC de 0,64 μL/mL. Os resultados da inibição do tubo germinativo em Candida albicans,
um fator importante de patogenicidade na invasão de tecidos, demonstraram que o óleo
essencial inibiu totalmente a formação do tubo germinativo na concentração de 0,64 μL/mL
e na concentração de 0,08 μL/mL foi ainda observada uma elevada percentagem de inibição
(63,2%) em comparação com as células não tratadas. O fato do óleo inibir a sua formação,
torna-o um promissor agente antifúngico com potencial utilização na indústria farmacêutica.
Entre os fungos dermatofitos testados, o Epidermophyton floccosum foi o que
apresentou maior sensibilidade ao óleo essencial com um MIC de 0,64 μL/mL, sendo esta
concentração não citotóxica para os queratinócitos. Este fato evidencia a potencial aplicação
tópica do óleo no tratamento de infeções causadas por dermatófitos.
Com base nos valores de MIC obtido, verificou-se que, a Listeria monocytogenes e a
Staphylococcus aureus foram as estirpes mais sensíveis ao óleo essencial com um MIC de 2,5
μL/mL.
O estudo da atividade anti-inflamatória do óleo, avaliada pela inibição da produção do
NO, demonstrou que o mesmo não apresenta bioatividade quando testado em
concentrações não tóxicas. O óleo essencial demonstrarou ainda ausência de toxicidade
para a maioria das célulasestudadas quando utilizado em concentrações iguais ou inferiores
a0,64 μL/mL. Na linha celular de intestino humano o óleo essencial não apresentou
citotoxidade significativa para concentrações inferiores a 0,32 μL/mL.
Relativamente à avaliação da atividade antioxidante, o óleo essencial demonstrou
inibição significativa da peroxidação lipídica na ausência do indutor (ABAP).
Em síntese, o presente trabalho permite concluir que o óleo essencial de R. officinalis
apresenta potencial terapêutico como fungicida no tratamento tópico de dermatofitoses,
quando utilizada em concentrações não superiores a 0,64 μL/mL. Adicionalmente o óleo
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essencial poderá ser utilizado como um antioxidante natural na preservação dos alimentos,
sendo a sua aplicação por via oral segura para concentrações inferiores a 0,32 μL/mLThe Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) is a medicinal aromatic plant of the Lamiaceae
family widely recognized for its use in cooking and in the pharmaceutical, food and cosmetic
industries. This is a adequately perennial adapted species to the mediterranean climate of
Portugal, being characterized by having a high content of essential oils. Essential oils are low
molecular weight compounds capable of crossing the blood-brain barrier generally free of
toxicity and which have different biological properties such as antioxidant, anti-inflammatory
and antimicrobial.
Diseases caused by infectious microorganisms, including fungi and bacteria represents a
serious risk to populations all over the world, mainly because of developing resistance to
synthetic antimicrobials. Moreover, the oxidation as well as microbial contamination have
been important causes of food spoilage, causing large economic loss and public health
problems. Thus, the demand for natural antimicrobials has aroused great interest in the
medical and scientific community.
Oxidative stress associated with chronic inflammation has recently been recognized as
a key factor in the pathophysiologic changes seen in a wide range of diseases such as cerebral
dysfunction, cancer, cardiovascular disease, liver disease and decline of the immune system.
In this case molecules possessing anti-inflammatory properties and antioxidant
simultaneously have a high therapeutic potential in the treatment of these pathologies.
It was intended with this work to evaluate the biological potential of essential oils
derived from R. officinalis coming from Portugal and also study its antifungal activity against
various strains of yeast and filamentous fungi, both pathogenic to humans and other animals,
including inhibition of germ tube in Candida albicans, an important virulence factor. Also the
antibacterial activity against strains of food borne pathogenic bacteria was evaluated based
on the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum lethal concentration (MLC).
The anti-inflammatory potential of the R. officinalis essential oil was also evaluated using
an in vitro model representing a peripheral inflammation, using the macrophage cell line
(RAW 264.7) stimulated with receptor agonist of Toll-like 4, lipopolysaccharide (LPS). In the
presence of bacterial products such as LPS, the macrophages produce pro-inflammatory
mediators including nitric oxide (NO), responsible for amplification of the inflammatory
response. In parallel we tested the cytotoxicity of the essential oil in the same cell line and
with the presence of LPS as well as their cytotoxicity in several human cell lines alveolar
epithelial (A549), keratinocytes (HaCaT), hepatocytes (HepG2) and intestinal (Caco-2 ) with
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the objective of identifying bioactive concentrations of the essential oil and free from
toxicity.
Also with the present study we evaluated the antioxidant activity of the essential oil by
the method of reactive substance of thiobarbituric acid (TBARS) in the presence and
absence of an inducing lipid peroxidation (ABAP).
The tests on the evaluation of the antifungal activity showed that the Cryptococcus
neoformans was the yeast that showed higher sensitivity to essential oil with MIC values of
0.64 μL/mL. The results of the inhibition of Candida albicans germ tube in a major pathogenic
factor in tissue invasion, demonstrated that the essential oil completely inhibited germ tube
formation in a concentration of 0.64 μL/mL and the concentration of 0.08 μL/mL was
observed even a high percentage of inhibition (63.2%) compared to untreated cells. The fact
that the oil inhibit its formation, makes it a promising antifungal agent with the potential use
in the pharmaceutical industry.
Among the dermatophytes fungi tested, Epidermophyton floccosum was introduced
more sensitive to the essential oil with a MIC of 0.64 μL/mL, which is non-cytotoxic
concentration to keratinocytes. This fact highlights the potential oil topical application in the
treatment of infections caused by dermatophytes.
Based on MIC values obtained, it was found that, Listeria monocytogenes and
Staphylococcus aureus strains were more sensitive to the essential oil with an MIC of 2.5
μL/mL.
The study oil anti-inflammatory activity as assessed by inhibition of NO production, has
demonstrated that it shows no bioactivity when tested at non-toxic concentrations. The
essential oil also demonstrated the absence of toxicity to most cells studied when used in
concentrations equal or inferior to 0.64 uL / mL. In the human intestine cell line essential oil
showed no significant cytotoxicity at concentrations below 0.32 μL / mL.
Regarding the evaluation of antioxidant activity, the essential oil showed significant
inhibition of lipid peroxidation in the absence of inducer (ABAP).
In summary, this study shows that the essential oil of R. officinalis has therapeutic
potential as a fungicide in the topical treatment of dermatophytosis, when used in
concentrations not exceeding the 0.64 μL / mL. Additionally, the essential oil may be used as
a natural antioxidant in food preservation, and their application for safe orally at less than
0.32 μL/mL
