Osteoarthritis (OA), the most common form of arthritis, is estimated to be in the top 5 leading causes of disability worldwide. Yet OA incidence is estimated to keep growing partly due to the overall worldwide trend of increased obesity and ageing population. Cartilage erosion, a hallmark of OA, has its onset in the traumatic events caused by incorrect biomechanical loading of the joint and the consequent biological response. Currently we still poorly comprehend the molecular pathophysiology of preclinical and clinical symptomatic OA, which consequently results in no current available therapy to prevent OA progression. We hypothesize that innate immunity and its receptor, in particularly toll-like receptors (TLRs), could be major drivers of OA disease progression and onset. The process could be initiated as a proinflammatory reaction against extracellular matrix (ECM)-derived damage-associated molecular patterns (DAMPs). DAMPs accumulate in avascular articular cartilage as a result of traumatization and degeneration, leading directly at their source to a reactive chondrocyte-mediated and TLR-dependent production of proinflammatory and algogenic secondary mediators, which then cause a secondary synovitis with consequent joint pain. For this propose, we collected cartilage and isolated primary chondrocytes from a total of 27 OA patients. Synovial fluid was obtained from knee meniscectomy, total knee arthroplasty (TKA) due to OA, and rheumatoid arthritis (RA) patients generating a total of 30 patient samples. HEK (human embryonic kidney)-blue TLR4 reporter cell line, primary OA chondrocytes, and cartilage explants were used for functional studies. Our results confirmed that TLR1, TLR2 and TLR9 expression is present in healthy primary chondrocytes isolated from articular cartilage, and derived from chondroprogenitors. During our chondrogenesis differentiation studies initial high expression of TLR1, TLR2 and TLR9 was significantly reduced to baseline levels.
We demonstrated that proinflammatory cytokine tumour necrosis factor alpha (TNF-α) is able to increase the expression of TLR2 in both healthy primary chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSC) derived chondrocytes cultured for 21 days. TNF-α stimulation was demonstrated to induce cartilage degradation in de novo ECM matrix from pellet cultures of MSC-derived chondrocytes cultured for 21 days. This implicates TNF-α as an inducer of matrix degradation, with wide implications in the use of MSCs strategies in cartilage repair strategies for OA. Our study also added further evidence of a role for TNF-α in TLR-innate immunity in the OA synovial joint.
TLRs protein expression in cartilage between knee and first carpometacarpal (CMC-I) joints from OA patients was shown to be strikingly different. Our study demonstrated for the first time all TLRs being expressed at protein levels in articular cartilage from knee OA patients. Moreover, we demonstrated that their expression is up-regulated in a cartilage zone-dependent fashion accordingto the histological progression of knee OA. TLRs expression in cartilage from CMC-I OA patients was highly heterogeneous although it followed an expression pattern according to TLRs cellular organization. This indicates that TLR-mediated innate immune response between the two joints may be significantly different.
Decorin (DCN), a known small structural proteoglycan with leucine-rich repeats (SLRP) ligand able to activate TLR2 and TLR4, was discovered in knee synovial fluid from OA and RA patients. We confirmed the ability of soluble DCN (sDCN) to activate to TLR4 signaling. However, the observed low and stable concentration levels across the studied groups mean that this may not be of clinical relevance in OA pathogenesis and the associated TLR-mediated inflammatory events. Biglycan (BGN), another known SLRP ligand able to activate TLR2 and TLR4, was discovered in knee synovial fluid from OA and RA patients. Interestingly, we discovered that soluble BGN (sBGN) is upregulated in synovial fluid from OA and RA patients. sBGN ability to activate TLR-innate immunity as confirmed to be essentially activated through TLR4 signaling by studies in articular chondrocytes and human HEK-blue TLR4 reporter cell line. The sBGN stimulation lead to the upregulation and release of proinflammatory cytokines, matrix-degrading enzymes and the release of ECM degradation products. Overall, the results of this thesis demonstrate that TLRs are markedly present in articular cartilage from OA patients at different progression stages of the disease. The detection of BGN and DCN in synovial fluid, and their ability to activate TLR4-mediated proinflammatory cellular responses gives new knowledge of proinflammatory molecules present in the OA synovial joint. An enhanced molecular understanding of the triggering mechanisms by which TLRs are activated and regulated during OA progression stages may help find therapeutic options in the treatment of OA.Osteoartriitti (OA) on maailmanlaajuisesti yleisin niveltulehduksen syy ja se on myös merkittävä vammautumisen ja invaliditeetin aiheuttaja. OA:n indsidenssin arvioidaan edelleen lisääntyvän johtuen väestön ikääntymisestä ja ylipainon lisääntymisestä. Nivelrikolle on ominaista ruston vaurioituminen joka voi alunperin olla vamman laukaisema tai sille on voinut altistaa vääränlainen biomekaaninen kuormitus. Tunnemme toistaiseksi varsin huonosti prekliinisen ja kliinisen OA:n patofysiologiaa ja siitä syystä käytössämme ei ole spesifistä lääkehoitoa, jonka avulla voisimme estää OA:n etenemistä. Väitöskirjatyön hypoteesina on että sisäsyntyinen immuunijärjestelmä ja sen reseptorit, erityisesti TOLL-like reseptorit (TLR), ovat merkittävä tekijä OA:n patogeneesissä ja taudin etenemisessä. Degeneraation ja mikrotraumojen seurauksena rustosta vapautuu damage-associated molecular patterns (DAMPs) jotka ruston huonosta verenkierrosta johtuen jäävät rustoon ja kertyvät sinne. Siellä ne aktivoivat kondrosyyttejä tuottamaan tulehdusta aiheuttavia yhdisteitä.Väitöskirjatyötä varten kerättiin rustoa 27:ltä OA potilaalta ja rustosta eristettiin primäärisiä kondrosyyttejä. Synovia nestettä kerättiin nivelrikko- ja nivelreumapotilailta polven kierukan poiston tai keinoniveloperaation yhteydessä. Totesimme tutkimuksessa että normaalista rustokudoksesta eristetyt kondrosyytit ilmentävät TLR1, TLR2 ja TLR9 reseptoreita. Edelleen totesimme että tuumorinekroositekijä (TNF)-α lisää TLR2 ilmentymistä kondrosyyteissä. TNF-α on saa aikaan ruston matriksin degradaatiota. Tällä on merkittäviä implikaatioita esimerkiksi ruston kantasolujen käytössä ruston korjaukseen. Väitöskirjatyössä todettiin myös että TOLL-like reseptorien ilmentyminen artroottisessa polvessa ja peukalon tyvinivelessä (CMC-1 nivel) on hyvin erilainen. Havainto viittaa siihen että luontaisen immuniteetin aktivoituminen polvessa ja CMC-1 nivelessä on hyvin erilainen. Biglykaani (BGN) on liukoinen pieni proteoglykaani. BGN kykenee aktivoimaan TLR2 ja TLR4 reseptoreita. Totesimme että liukoisen BGN:n (sBGN) määrä on lisääntynyt OA ja RA nivelnesteessä. sBGN sai aikaan proinflammatoristen sytokiinien ja ruston matriksia hajottavien entsyymien vapautumisen rustosta TLR4 välitteisesti. Kaikkiaan väitöskirjatyön tulokset osoittavat että TLR-reseptorit ilmentyvät artroottisessa rustokudoksessa ja niiden määrä korreloi OA:n progressioon. BGN aktivoi immunijärjestelmää ja saattaa olla tärkeä tulehduksen aiheuttaja OA:ssa. Kun ymmärrämme paremmin TLR-reseptorien merkitystä ja aktivaatiota artroottisessa nivelessä se saattaa tarjota uusia kohteita uudenlaisille lääkehoidolle OA:n hoitoon
