Herrmann, Susan Strange

N-nitrosaminer (NA) forekommer i kødprodukter som bacon, pølser, skinke og andre typer af kødpålæg konserveret med natrium nitrit (nitrit). Flere af disse NA er kræftfremkaldende og i nogle epidemiologiske undersøgelser er der endvidere fundet sammenhæng mellem højt indtag af forarbejdet kød og øget risiko for kræft og andre negative effekter på helbredet. Eksponering for NA via kødprodukter kan være årsag til den sammenhæng. Indholdene af NA i forarbejdet kød bør derfor være så lave som muligt. Et stort antal publikationer vedrørende forekomsten, dannelsen samt afværgelse af dannelsen af NA er allerede tilgængelige, men der er stadig flere områder, særligt vedrørende de ikke flygtige NA (NVNA), som ikke er afdækket. Antallet af undersøgelser udført på egentlige kød produkter er ligeledes begrænset. Jo mere der er kendt omkring hvilke faktorer der påvirker dannelsen af både de flygtige NA (VNA) og NVNA, jo større sandsynlighed er der for, at man kan identificere strategier, hvorved dannelsen af NA generelt kan forhindres og ikke kun for nogle få NA. Formålet med denne afhandling var derfor, at undersøge betydningen af den tilsatte mængde af nitrit samt betydningen af faktorer af relevans for industriel forarbejdning af kød, fedt indhold og varmebehandling på dannelsen af VNA og NVNA. Ydermere skulle der genereres data vedrørende forekomsten af VNA og NVNA i forarbejdede kødprodukter på det danske marked til brug for en evaluering af eksponeringsniveauet ved konsum af forarbejdet kød. Der er ikke tidligere i litteraturen beskrevet nogen analytisk metode til samtidig bestemmelse af VNA og NVNA. For at opfylde det beskrevne formål blev der, som en del af projektet udviklet og valideret en metode baseret på acetonitril ekstraktion samt væskekromatografi tandem-massespektrometri med både atmosfærisk tryk kemisk ionisering og elektrospray ionisering. Data vedrørende forekomsten af NA i forarbejdede kødprodukter blev opnået ved, at analysere produkter udtaget fra det danske marked. De gennemsnitlige indhold af de enkelte VNA var generelt lave (≤0.8μg kg-1), hvorimod de gennemsnitlige indhold af de enkelte NVNA var markant højere (≤118 μg kg-1). N-nitrosodimethylamin (NDMA) and N-nitrosopyrrolidin (NPYR) var de hyppigst detekterede VNA og de hyppigst detekterede NVNA var N-nitrosothiazolidine-4- carboxylsyre (NTCA) and N-nitroso-2-methyl-thiazolidine-4-carboxylsyre (NMTCA). Indholdene af NTCA var høje, dvs. op til 2000 μg kg-1. Højere gennemsnitlige indhold af både de VNA (≤1.5 μg kg-1) og NVNA (≤270 μg kg-1) blev fundet for prøver udtaget i Belgien, denne forskel var dog ikke signifikant. Dvs. til trods for at Danmark opretholder nationale regler der tillader tilsætning af højest 60 mg kg-1 nitrit, hvorimod de fælles EU regler tillader 150 mg kg-1, kunne der ikke demonstreres nogen klar forskel mellem de gennemsnitlige indhold i de danske og belgiske prøver. Sammenhængen mellem den tilsatte mængde af nitrit og indholdene af VNA og NVNA blev undersøgt både i hakket kød og pølser. Der blev påvist positiv sammenhæng mellem stigende indhold af N-nitrosohydroxyprolin (NHPRO), N-nitrosoprolin (NPRO), NTCA, NMTCA, Nnitrososarcosin (NSAR) og N-nitrosopiperidin (NPIP) og stigende mængde af tilsat nitrit. Denne relation blev ikke fundet for de hyppigst undersøgte VNA, NDMA og NPYR. Indholdene af disse forblev lave selv ved tilsætning af 350 mg kg-1 nitrit. Studier foretaget af andre har indikeret, at særligt dannelsen af NDMA er mere relateret til faktorer som kødkvalitet herunder også fodersammensætning og/eller avlsforhold, forarbejdningsfaktorer som valg af temperatur og længde af tørring og opbevaring end til mængden af tilsat nitrit. En række undersøgelser blev udført, for at vurdere betydningen af natriumklorid, antioxidanter (erythorbinsyre og ascorbyl palmitat), natriumtripolyfosfat, dextrose, fedtindhold, sort peber og tid for dannelsen af NA. Faktorforsøg blev anvendt for, at opnå så mange informationer som muligt med et håndterbart antal prøver. Den tilsatte mængde af nitrit samt tilsætning af erythorbinsyre viste sig, at have størst betydning for hvor indholdene af NA. Indholdene af NHPRO, NPRO, NPIP, NTCA og NMTCA var omvendt relateret til mængden af erythorbinsyre (396-1104 mg kg-1) og indholdene for de enkelte NA blev reduceret med op til 20 til 75%. At også tilsætte ascorbylpalmitat, en fedtopløselig antioxidant, forhindrede ikke NA-dannelsen yderligere. Natriumklorid havde begrænset effekt på NA-indholdene i forhold til nitrit og erythorbinsyre. NA blev dannet hurtigt og indholdene forblev relativt stabile selv efter 13 dages opbevaring. Sort peber øgede indholdene af NPIP signifikant. Tilsætning af Fe(III) øgede indholdene af NHPRO, NMTCA and NTCA, hvorimod hæm ikke havde nogen effekt. En klar positiv sammenhæng blev påvist mellem varmebehandling og stigning i indholdene af NPIP i alle de udførte varmebehandlingseksperimenter. Afhængig af hvilken temperatur der blev opnået i kødet varierede effekten på de øvrige NA. Ved stegning af pølserne fremstillet med forskellige tilsætninger af nitrit til en centrum temperatur på 100°c steg indholdene af NSAR, NTCA og NMTCA. Ved varmebehandling af produkter købt i de lokale supermarkeder og slagtere til højere temperaturer (~250°C) faldt indholdene af NTCA og NMTCA. Både stigning og fald i indholdene af of NPRO, NPYR, N-nitrosodiethylamin (NDEA) og Nnitrosomethylanilin (NMA) blev observeret afhængig af produkt og varmebehandling. Udfra de data der blev generet vedrørende forekomsten af NA i forarbejdede kødprodukter på det danske marked, blev eksponeringen for VNA (estimeret som 95 percentilen) via konsum af disse produkter estimeret til at være 0.5 ng kg legemsvægt-1 dag-1 and 1.6 ng kg legemsvægt-1 dag-1 for hhv. voksne og børn. ”Margins of Exposure” blev ud fra dette eksponeringsniveau beregnet til at være over 10.000 og giver derfor ikke anledning til bekymring. Det kan imidlertid ikke udelukkes at eksponeringen for VNA fra forarbejdede kødprodukter ligger til grund for den stærkere sammenhæng mellem øget risiko for kræft of andre negative effekter på helbredet og indtag af forarbejdet kød end med indtaget af rødt kød. Eksponering for NVNA blev estimeret til at være markant højere (47-129 ng kg legemsvægt-1 dag-1). Denne eksponering kan dog ikke risiko vurderes pga. manglende data vedrørende den toksikologiske relevans af disse stoffer. Samlet set har denne afhandling vist, at hvis den tilsatte mængde af nitrit anvendt ved kødkonservering og/eller farvning øges, øges også indholdet af NA generelt. Eksponering for NA bør pga. de mulige negative helbredseffekter være så lav som muligt. Ud fra den nuværende viden vurderes det at lave indhold af NA i forarbejde kødprodukter bedst opretholdes ved, at så lidt nitrit som muligt tilsættes og ved at nitrit anvendes i kombination med erythorbinsyre (~1000 mg kg-1) eller en anden C-vitamin forbindelse. Det forarbejdede kød bør opbevares beskyttet mod ilt for at forhindre at erythorbinsyre bliver opbrugt. Den Europæiske Fødevaresikkerhedsautoritet har konkluderet, at den mikrobielle sikkerhed af kød generelt kan opretholdes ved at tilsætte 50 mg kg-1 nitrit. Dette kan skyldes at de relevante precursore ikke er tilstede. Andre midler kan også tages i brug udover tilsætning af nitrit for at sikre den mikrobielle sikkerhed. Forekomsten af de kræftfremkaldende NDMA og NPYR tyder dog ikke på at være relateret til mængden af nitrit eller erythorbinsyre.N-nitrosamines (NA) occur in sodium nitrite (nitrite) preserved meat products as bacon, sausages, ham and several types of luncheon meats. Several of these NA are carcinogenic and high intake of processed meat products has been associated with increased risk of cancer and other adverse health effects in some epidemiologic studies. Exposure to NA via meat products may be the underlying reason for this association. The levels of NA in processed meat products ought therefore to be as low as possible. There is a large amount of literature on the occurrence, formation and mitigation of NA in meat products already available, though several areas especially regarding non-volatile NA (NVNA) are relatively unexplored. Studies performed in actual meat products are also scarce. The more that is understood about which factors affects the formation of both volatile NA (VNA) and NVNA the more likely is it to identify strategies for the prevention of NA formation in general and not only for a few NA. The aim of the present thesis was therefore to study the role of ingoing amount of nitrite, factors relevant for industrial processing of meat, fat content and the effect of heat treatment on the formation of VNA and NVNA in meat. Secondly data on the occurrence of VNA and NVNA in processed meat products on the Danish market were to be generated and used for an evaluation of the exposure level resulting from consumption of processed meat products. A method allowing for the simultaneous determination of both VNA and NVNA has not been described in the literature. In order to meet the defined aims, a method based on acetonitrile extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry using both atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation was developed and validated. Data on the occurrence of NA in processed meat products was obtained by analysing products taken from the Danish market. The mean levels of the individual VNA were generally found to be low (≤0.8μg kg-1), whereas the mean levels of the individual NVNA were considerably higher (≤118 μg kg-1). The most frequently detected VNA were N-nitrosodimethylamine (NDMA) and Nnitrosopyrrolidine (NPYR) and the most frequently detected NVNA were N-nitrosothiazolidine-4- carboxylic acid (NTCA) and N-nitroso-2-methyl-thiazolidine-4-carboxylic acid (NMTCA). NTCA occurred at high levels, i.e. up to 2000 μg kg-1. Higher mean levels of both the VNA (≤1.5 μg kg-1) and NVNA (≤270 μg kg-1) were found in samples taken from the Belgian market, though the difference was not significant. Thus in spite of the National Provision that Denmark obtain allowing an ingoing amount of sodium nitrite of 60 mg kg-1 instead of 150 mg kg-1 according to EU regulation, no significant differences between the mean levels of NA in the Danish samples and the Belgian samples could be demonstrated. The relationship between the ingoing amount of nitrite and the levels of VNA and NVNA was studied in both minced meat and sausages. The levels of N-nitrosohydroxyproline (NHPRO), Nnitrosoproline (NPRO), NTCA, NMTCA, N-nitrososarcosine (NSAR), and N-nitrosopiperidine (NPIP) were found to be positively related to the ingoing amount of nitrite. The same could not be demonstrated for the commonly assayed NDMA and NPYR of which the levels remained low even when 350 mg kg-1 nitrite was added. This may indicate that the relevant precursors are not present. Studies by others have indicated especially the formation of NDMA to depend more on factors as meat quality including feeding and/or breeding conditions and processing factors as temperatures and duration of drying and storage than on the ingoing amount of nitrite. A range of studies were performed using both minced pork meat and sausages in order to evaluate the effects of sodium chloride, antioxidants (erythorbic acid and ascorbyl palmitate), sodium tripolyphosphate, dextrose, fat content, black pepper and time on the NA formation and their interactions with nitrite and each other. Factorial experiments were employed in order to gain as much information with a reasonable number of samples. The ingoing amount of nitrite and the presence of erythorbic acid affected the levels of NA most. The levels of NHPRO, NPRO, NPIP, NTCA and NMTCA were inversely related to the amount of erythorbic acid (396-1104 mg kg-1). The levels of the individual NA were reduced with up to 20 to 75%. No additional protection against NA formation was obtained by also adding ascorbyl palmitate, a fat soluble antioxidant. Sodium chloride was found to have minor effects on the NA levels compared to nitrite and erythorbic acid. The NA formation happened rapidly and was relatively unaffected by storage for up to 13 days. Black pepper significantly increased the levels of NPIP. Fe(III) increased the levels of NHPRO, NMTCA and NTCA, whereas haem had no effect on the NA levels. A clear positive effect of heat treatment on the levels of NPIP was demonstrated in all the heat treatment experiments performed. Depending on the temperature obtained in the meat different effects were found for the other NA. If the sausages produced with different levels of nitrite were fried until a centre temperature of 100°C also the levels of NSAR, NTCA and NMTCA increased. Though when products purchased at the local supermarkets and butcher stores were heated to a higher temperature (~250°C), the levels of NTCA and NMTCA decreased. Depending on the product and heat treatment the levels of NPRO, NPYR, Nnitrosodiethylamine (NDEA) and N-nitrosomethylaniline (NMA) either increased or decreased. From the data acquired on the occurrence of NA in meat products on the Danish market it was estimated that consumption at the 95th percentile of these products resulted in an exposure to VNA of 0.5 ng kg bw-1 day-1 and 1.6 ng kg bw-1 day-1 for Danish adults and children, respectively. The calculated Margin Of Exposure (MOE) was well above 10,000 indicating that the exposure is of low concern. Though, it cannot be ruled out that the exposure to these VNA is accountable for the stronger association between adverse health effects and consumption of processed meat than for consumption of red meat. The 96th percentile exposure to the NVNA was estimated to be considerably higher (47-129 ng kg bw-1 day-1); though this exposure level is not possible to risk assess because data concerning the toxicological relevance of these compounds are lacking. Overall the present thesis show that if nitrite is used for meat preservation and/or colouration the levels of NA generally increase. Because of the possible adverse health effects of NA the exposure level ought to be kept at a minimum. Based on the present knowledge it is evaluated that low levels of NA in processed meat products are best achieved by using as little nitrite as possible and use it in combination with erythorbic acid (~1000 mg kg-1) or another C-vitamin compound. Furthermore by storing the processed meat products protected from oxygen, depletion of the erythorbic acid is prevented. The European Food Safety Authority has concluded that microbiological safe meat products generally may be produced by the addition of 50 mg kg-1 of nitrite. Other means besides nitrite addition can insure the microbiological safety. However, the occurrence of the carcinogenic NDMA and perhaps NPYR seems neither to be related to the levels of nitrite or to the levels of erythorbic acid.</sup

Online Research Database In Technology

N-nitrosamines in processed meat products – analysis, occurrence, formation, mitigation and exposure

http://orbit.dtu.dk/ws/files/103384341/PhD_thesis_Susan_Strange_Herrmann.pdf

N-nitrosamines in processed meat products – analysis, occurrence, formation, mitigation and exposure

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Online Research Database In Technology