Horváth, László

Kolics, Balázs

Kovács, Balázs

Kucharczyk, Darek

Müller, Tamás

Taller, János

Várkonyi, Levente

Repository of the Academy's Library

MAGYAR ÁLLATORVOSOK LAPJA | 2015. JÚLIUS   137. / 411-414. iHALIdentification of European eel juvenile by using PCR-RFLPKolics, B.1*Kovács, B.2Taller, J.1Várkonyi, L.2Horváth, L.2Kucharczyk, D.3 Müller, T.1*B. Kolics1*B. Kovács2J. Taller1L. Várkonyi2L. Horváth2D. Kucharczyk3T. Müller1*1. Pannon Egyetem Georgikon KarH-8360 Keszthely, Deák F. u. 16. * e-mail: bkolics@gmail.com, muller.tamas@mkk.szie.hu2. SZIE Mezőgazdaság- és Környezet- tudományi Kar Akvakultúra és Környezetbiztonsági Intézet, Halgazdálkodási TanszékGödöllő3. Department of Lake and River Fisheries, Faculty of Environmental Science, University of Warmia and Mazury in Olsztyn, PolandEurópai angolna ivadékának  fajmeghatározása PCR–RFLP- módszerrelÖSSZEFOGLALÁSEgy faj pontos meghatározása a CITES-fajok esetében kritikus jelentőségű, külö-nösen azok illegális szállítása esetén. Egy közelmúltban történt eset világított rá ennek jelentőségére, ahol is több mint félmillió ismeretlen eredetű és fajú angolnalárvát foglalt le a reptéri rendőrség (Liszt Ferenc Nemzetközi Repülőtér, Budapest). A lefoglalt szállítmányt érintően mielőbbi döntéshozatal volt szük-séges, amely a gyors fajmeghatározási technológiák fontosságára világított rá. Angolnafajok esetében a hagyományos morfológiai alapú eljárások félrevezetőek lehetnek, és bizonyos lárvakorban nem is alkalmazhatók. Ezzel szemben a mole-kuláris módszer pontos és gyors fajmeghatározást tesz lehetővé. A szerzők egy sejtmagi gén, az FSH 100 bp hosszú szakaszát szaporították fel; az európai (A. anguilla) és a japán (A. japonica) angolna közti különbséget PCR–RFLP-eljárással mutatták ki. A nukleáris markerekre alapozott molekuláris eljárások széles kör-ben használhatóak, a faj meghatározásán kívül hibridizációs vizsgálatokban is.SUMMARYSpecies discrimination is crucial in illegal transport of CITES species. A recent case at the Hungarian International Airport (Budapest, Hungary) where over half a million of individuals of unidentified juvenile eel (Anguilla sp.) were seized also called for a prompt decision and reflected the importance of rapid techniques identification. Instead of morphological investigation, that could be misleading and unapplicable in certain juvenile developmental stage, molecular methods proved to be the eligible way of eel species discrimination. A nuclear marker, a 100bp fragment of the FSH gene was used to distinguish the European eel (A. anguilla) and Japanese eel (A. japonica) in glass eel stage using PCR-RFLP technique. Molecular method based on nuclear markers enables a wide range of identification as species discrimination of any developmental stage and also hybrid testing. 412HAL EURÓPAI ÉS JAPÁN ANGOLNA ELKÜLÖNÍTÉSEA Washingtoni Egyezmény a veszélyeztetett vadon élő állat- és növényfajok nemzetközi kereskedelméről (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITES) II. kategóriába sorolja az európai angolnát (Anguilla anguilla): nem fenyegeti a kihalás közvetlen veszélye, de befogásukra és kereskedésükre súlyos korlátozások vonatkoznak. Az angolna egy másik fajának, a japán angolnának (A. japonica) a kereskedelmét nem szabályozza a CITES.A két faj természetes elterjedési területén kívül is kereskednek angolnával (az egyik járulékos hozadéka volt az Anguillicoides crassus japán angolnában élő úszóhólyagféreg behurcolása európai vízterekbe, amely parazita kártétele a balatoni állományban is érzékeny veszteségeket okozott [3, 9]), így a két faj ivadékainak elkülönítése különösen fontos. Fontos kiemelni, hogy morfológiai bélyegek alapján az elkülönítésük nehéz (6), és nem minden esetben biztos. A két faj elkülönítésére először mitokondriális markerekre alapozott molekulá-ris technikák váltak ismertté (1, 6, 8). Az anyai öröklődésű marker azonban bizo-nyos esetekben (pl. hibridvizsgálatnál) nem alkalmazható. Ennek alternatívája a mikroszatellit alapú megközelítés (4), azonban a módszer csak korlátozottan alkalmas fajok elkülönítésére, költségesebb és időigényes az egyszerűbb PCR–RFLP-eljárásokkal szemben.ANYAG ÉS MÓDSZER2014. április 23-án a Nemzeti Adó- és Vámhivatal pénzügyőrei összesen 183 kg tömegű (kb. 610 ezer egyed) angolnaivadékot (Anguilla sp.) foglaltak le két kínai utas csomagjaiból a Liszt Ferenc Nemzetközi Repülőtéren. A rendelkezésre álló információk alapján felmerült annak a lehetősége, hogy az angolnaivadékok a japán angolnafajba tartoznak, így szállításuk engedélyeztetése más elbírálás alá esik. Kutatócsoportunkat felkérték a lefoglalt szállítmány faji meghatározá-sára a további intézkedések meghozatala céljából. Ötven véletlenszerűen kiválasztott angolnaivadékot vizsgáltunk meg a jel-lemző morfológiai bélyegek alapján (postanalis és dorsanalis testhosszok lemé-rése), és 12 példányt választottunk ki véletlenszerűen DNS-marker alapú vizs-gálatra  (1. ábra). Japánangolna-kontrollnak korábbi vizsgálatainkból származó mintákat használtunk, míg európaiangolna-kontrollnak Balatonból származó egyede úszómintáját használtunk fel. Az európai angolna és a japán angolna hibridizációjának igazolását a két faj FSH-génjében található pontmutációra alapozva végeztük el (PCR–RFLP) (5). Az erre a faji különbségre tervezett mole-kuláris genetikai markerrel egyértelműen igazolni lehet a minták faji hovatar-tozását. A DNS-kivonás Qiagen DNEasy Tissue Kittel történt; 12 példányból 11 esetében jó minőségű (nem fragmentált) és megfelelő koncentrációjú (80–170 ng/µl) DNS-t sikerült kivonni. A DNS-kivonást követően a mintákon a következő összetevőkkel indítottunk PCR-t 12 µl végtérfogatban: egyenként 1,2 µM Primer; egyenként 0,2 µM DNTP; 1,5 U Taq-polimeráz enzim 10× pufferrel (Thermo Scientific, Litvánia); 2 mM MgCl2; 1 µl templát-DNS (100 ng). Alkalmazott PCR-profil: 94 °C 2 perc előmelegítést követően 33 ciklus a következő hőmérsékletekkel és idővel: 94 °C 30 s, 65 °C 30 s, 72 °C 30 s. Végső extenzió: 72 °C 5 perc. Az európai (EA+) és a japán angolna (JP+) elkülönítésére használt marker (5′-CAACAGGCCT-GCAACTTCA and 5′-CTCAGAGCCACAGGGTAGGT) az FSH-gén egy 100 bp hosszú szakaszát szaporítja fel. Végül a PCR-termékeket RsaI restrikciós endonukleázzal kezeltük: 1 µl enzimet adtunk közvetlenül 10 µl PCR-termékehez. Az enzim az európai angolna szekvenciáját a 40. bázispárnál elvágja, míg a japán angolnából A Washingtoni Egyez-mény alapján az európai angolna befogására és kereskedelmére súlyos korlátozások  vonatkoznakAz európai angolna és a japán angolna ivadékainak morfológiai elkülönítése bizonytalanA szerzők a NAV által lefoglalt angolnaivadék-szállítmány faji megha-tározását végezték elRFLP-módszerrel vizsgálták az FSH-gén PCR-rel sokszorosított szakaszát413MAGYAR ÁLLATORVOSOK LAPJA | 2015. JÚLIUSszármazó fragmentet érintetlenül hagyja. A termékeket az emésztést követően 3%-os agarózgélen (Prolabo, Németország) választottuk el, és 1,5%-os etídium-bromiddal festettük meg. A vizsgált minták testhossza és testtömege nem mutatott erős összefüggést (y = 0,0781x - 0,2842, r2 = 0,47), ami különböző korú gyűjtött egyedekre utal, és/vagy egyik részük már megkezdte a táplálkozást és a növekedést, míg másik felük a metamorfózist követő pigmentációt nem fejezte be, táplálkozást még nem kezdte meg. Silfvergrip (7) által megadott elkülönítő bélyeg alapján az iva-dékokat nem lehetett egyértelműen besorolni  (Táblázat).A molekuláris vizsgálatok során egy minta (eel 6; 20 ng/µl ) kis koncentrációjú DNS-t adott, ami a minta tárolására volt visszavezethető.A marker DNS-szakasz nukleotidsorrendjében egyetlen bázispár különbség van az európai és a japán angolna között. Ezt az SNP-t (Single Nucleotide Poly-morphism) RSAI restrikciós enzimemésztéssel, gélelektroforézis segítségével vizualizáltuk. A PCR-termékek restrikciós endonukleáz-emésztése a vártnak megfelelően intakt, 100 bp nagyságú fragmentet eredményezett a japán angolna Az Rsal-enzim az euró-pai angolna esetében a PCR-terméket egy 60 és egy 40 bp hosszú-ságú fragmentre hasítja1. ÁBRA. Az egyik vizsgált angolnamintaFIGURE 1. One of the investi- gated specimen2. ÁBRA. A PCR termékek RFLP mintázata Rsa I enzim-mel, 1,5%-os agaróz gélenFIGURE 2. Measurements taken on the eel specimens (n = 50)M-DNS súlymarker (DNA Ladder Plus, Thermo Scientific) 100 bp, 3,5 µL. Az Angolna X 1-12 40 és 60bp nagyságú termékeket eredményezett, csakúgy, mint a kontrollként használt európai angolna (EA+). Az azonos PCR-reakcióból származó fragment a második kontroll-ként használt japán angolna esetében (JA+) érintetlen maradt az emésztés során. M-DNA Ladder Plus 100 bp, 3.5 µL. Angolna 1-12 gave digested fragments of 40 and 60 bp, same as the European eel used for control (EA+). Fragment from the prior PCR reac-tion remained undigested in the case of the Japanese eel sample used as the second control (JA+).414HAL EURÓPAI ÉS JAPÁN ANGOLNA ELKÜLÖNÍTÉSEkontrollmintája esetében, míg az európai angolna kontrollmintájából származó fragmentet az enzim egy 60 és egy 40 bp hosszúságú fragmentre hasította. A vizsgált mintákból származó kiindulási PCR-terméket az enzim az utóbbihoz hasonlóan minden vizsgált minta esetében elhasította. A vizsgált minták az európai angolnafajba tartoztak.Matsubara és mtsai egy kísérletben (3) mikroszatellit alapú vizsgálatokkal igazolták az A. japonica és az A. anguilla fajok hibridizációját. E módszer esetben azonban előzetes információval kell rendelkezni a szülői alléleket illetően. A génbanki adat-bázisokból elérhető A. australis és A. marmorata fajok FSH-génre alapozott in silico vizsgálataink szerint e fajok elkülönítése is lehetséges lehet a génszekvencia poli-morfizmusára alapozva. A korábban leírt PCR–RFLP alapú módszer (2) markerei a 18S rDNS-régiót célozzák, nem mutat allélpolimorfizmust az A. anguilla és az A. japonica fajok között, csak az A. australis, A. rostrata és A. luzonensis fajok elkü-lönítésére használható. Az általunk használt markerek egyértelmű, gyors és olcsó detektálási lehetőséget nyújtanak a japán és az európai angolnafajok elkülöníté-sében, továbbá azok hibridjeinek elkülönítésére is alkalmasak.KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁSA kutatást a KMR_12-1-2012-0435, a Bolyai János kutatási ösztöndíj (BO 54/12/4) és a Nemzeti Kiválóság Program (8526-5/2014/TUDPOL azonosító számú) pályá-zata támogatta.IRODALOM1. Aoyama, J. –  Watanabe, S. et al.: Discrimination of catadromous eels of genus Anguilla using polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism analysis of the mitochondrial 16S ribosomal RNA domain. Trans. Am. Fish. Soc., 2000. 129. 873–878.2. Burgerhout, E. – Brittijn, S. A. et al.: First artificial hybrid of the eel species Anguilla australis and Anguilla anguilla. BMC Dev. Biol., 2011. 11 (1). 16.3. Csaba G. – Láng M. – Sályi G. – Ramotsa J. – Glávits R. – Rátz F.: Az Anguillicola crassus (Nematoda, Anguillicolidae) fonálféreg és szerepe az 1991. évi balatoni angolnapusztulásban, Magy. Állatorv. Lapja, 1993. 48. 11–21.4. Matsubara, H. – Nomura, K. et al.: Can the hybrid between Japanese eel and European eel grow? Newslett. Jpn. Soc. Comp. Endocrinol., 2010. 36. 133–139.5. Müller, T. – Horváth, Á. et al.: Artificial hybridization of Japa-nese and European eel (Anguilla japonica × A. anguilla) by using cryopreserved sperm from freshwater reared males. Aquaculture, 2012. 350. 130–133.6. Keszka, S. – Panicz, R. – Kempter, J.: Eel species identification by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Med. Weter., 2009. 65. 315–318.7. Silfvergrip, A. M.: CITES identification guide to the freshwa-ter eels (Anguillidae): with focus on the European eel Anguilla anguilla. Swedish environmental protection agency, 2009.8. Minegishi, Y. – Yoshinaga, T. et al.: Species identification of Anguilla japonica by real-time PCR based on a sequence detec-tion system: a practical application to eggs and larvae. ICES J. Mar. Sci: Journal du Conseil., 2009. 66. 1915–1918.9. Székely, Cs. – Láng, M. – Csaba, G.: First occurrence of Anguil-licola crassus in Hungary. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol., 1991. 11. 162–163. Közlésre érk.: 2015. feb. 13.A vizsgált minták európai angolnafajba tartoztakTesttömeg (g)Teljes test-hossz (mm)Postanalis hossz a dorsanalis hossz függvényébensaját mérés Silfvergrip (7) alapjáneurópai angolnajapán angolnaÁtlag ± szórás0,29 ± 0,05g 73,3 ± 4,4 6,22 ± 0,77Min.–max. 0,21–0,42 6,14–8,47 4,6–7,8, 5–5,2 5,6–6,0TÁBLÁZAT. Angolnák felvett adatai (n = 50)TABLE Measurements taken on the eel specimens(n = 50) 

Európai angolna ivadékának fajmeghatározása PCR–RFLP módszerrel

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Repository of the Academy's Library