Analysis of the stress-induced modifications of nucleocytoplasmic trafficking in stressed mammalian cells

Abstract

Environmental stress is a fundamental factor that negatively impacts different cellular components and impinges on numerous aspects of cellular function. In fact, the ability of a cell to cope with different stressors determines its fate. One of the essential cellular systems which are targeted by stress is the nucleocytoplasmic transport apparatus. As such, the classical import pathway is inhibited by different forms of stress. The research presented in this thesis analyzed the effects of stress on nucleocytoplasmic transport with particular focus on how stress impinges on individual components of the transport apparatus. Furthermore, nuclear trafficking of the chaperone hsc70 and AMP-activated protein kinase (AMPK), which are implicated in numerous physiological processes have been analyzed under normal and stress conditions.To gain further insight into how stress regulates nucleocytoplasmic trafficking in eukaryotes HeLa cells were used as model system to analyze the effect of mild oxidative stress on the localization of soluble transport factors. My research revealed that oxidative stress mislocalizes transport receptors importin-α, and CAS as well as nucleoporins Nup153, and Nup88 all of which accumulate in nuclei upon oxidant treatment. In addition, I have shown that these soluble transport factors became immobile in the nuclei of stressed cells where they were retained in large insoluble complexes.A crucial component of the cell signaling machinery which is regulated by modulation of nuclear trafficking is AMPK. My research provided new insights into how different stressors affect the activation and subcellular localization of AMPK. As such, my results demonstrated that several forms of stress including heat, energy depletion and oxidants concentrate AMPK in nuclei. Furthermore, I showed that under normal growth conditions AMPK shuttles between the nucleus and cytoplasm, a process that depends on the nuclear exporter Crm1. Moreover, my results demonstrated that signaling through the MEK→ERK1/2 cascade plays a crucial role in controlling the localization of AMPK.In addition to AMPK, I focused on the effect of stress on heat shock protein 70 (hsc70), an essential component of the chaperoning machinery which plays a crucial role in the repair of stress-induced damage. Following stress exposure, hsc70 accumulates in nuclei, but relocates to the nucleoli and subsequently the cytoplasm when cells recover from stress. I have defined at the molecular level the mechanisms that control hsc70 transport in and out of the nucleus upon stress. Specifically, retention in nuclei and nucleoli of stressed cells was identified as the main cause that delays hsc70 exit from the nucleus. My research has identified the nucleolar components fibrillarin and the rpS6 ribosomal protein as interacting components of hsc70 which possibly anchor the chaperone in nucleoli upon stress. In addition, I have shown that libration of hsc70 from these anchors is a prerequisite to exit the nucleus.As part of my research objectives, my work was directed towards improving the technical approaches that are used to detect the subcellular distribution of proteins. To this end, I have developed a new quantitative immunofluorescence approach to analyze in a quantitative fashion the distribution of proteins in different subcellular compartments, including the nucleus, cytoplasm and nuclear envelope NE. The protocols described in this thesis were successfully employed to analyze the distribution of transport receptors and signaling molecules under normal and stress conditions. Developing new tools to quantify the levels of proteins in the different subcellular location opens the door to understand the dynamic organization of different cellular components and how such dynamic state regulates their function.Le stress environnemental est un facteur fondamental qui a des effets négatifs sur diverses composantes cellulaires. En fait, la capacité d'une cellule à faire face à différents éléments stressants va déterminer son sort. Un des systèmes cellulaires essentiel qui est ciblé par le stress est l'appareil du transport nucléocytoplasmique. Les recherches présentées dans cette thèse analysent les effets du stress sur le transport nucléocytoplasmique. De plus, le transport nucléaire de la chaperone hsc70 et de la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) ont été analysées sous des conditions normales et de stress.Afin d'obtenir un meilleur aperçu de la capacité du stress à réguler le transport nucléocytoplasmique chez les eucaryotes, les cellules HeLa furent utilisées comme système model pour analyser les effets d'un stress oxydatif léger sur la localisation des facteurs de transport solubles. Mes recherches révèlent que le stress oxydatif modifie la localisation des récepteurs de transport importine-α et CAS, ainsi que les nucléoporines Nup153 et Nup88 qui s'accumulent toutes dans les noyaux suite à un traitement oxydatif. De plus, je démontre que ces facteurs solubles de transport deviennent immobiles dans les noyaux de cellules stressées où elles sont retenues dans de grands complexes insolubles.Une composante cruciale de la machinerie de la signalisation cellulaire qui est régulée par la modulation du transport nucléaire est l'AMPK. Mes recherches fournissent de nouveaux aperçus sur la façon dont les différents éléments stressants affectent l'activation et la localisation subcellulaire de l'AMPK. Par exemple, mes résultats démontrent que plusieurs formes de stress incluant la chaleur, la réduction d'énergie et les agents oxydants concentrent l'AMPK dans les noyaux. De plus, je démontre que sous des conditions normales de croissance cellulaire, l'AMPK voyage entre le noyau et le cytoplasme, un processus qui dépend sur l'exportateur nucléaire Crm1. Par ailleurs, mes résultats ont démontrés que la signalisation par la cascade MEK-ERK1/2 joue un rôle crucial dans le contrôle de la localisation de l'AMPK.En plus de l'AMPK, je me suis concentré sur l'effet du stress sur la protéine de stress à la chaleur hsc70 (heat shock protein 70), une composante essentielle de la machinerie des chaperones qui joue un rôle crucial dans la réparation des dommages induits par le stress. Suite à une exposition à un stress, hsc70 s'accumule dans les noyaux, mais est ensuite relocalisée dans les nucléoles et subséquemment dans le cytoplasme pendant le rétablissement des cellules. J'ai défini, au niveau moléculaire, les mécanismes qui contrôlent le transport de hsc70 vers et hors du noyau lors d'un stress. Spécifiquement, la rétention dans les noyaux et les nucléoles des cellules stressées fut identifié comme cause majeure qui retarde la sortie de hsc70 du noyau. Mes recherches ont identifié la fibrillarine, composantes nucléolaire, ainsi que la protéine ribosomale rpS6 comme composantes qui interagissent avec hsc70 en ancrant possiblement la chaperone dans les nucléoles lors d'un stress.Faisant partie de mes objectifs de recherche, mon travail fut dirigé vers l'amélioration des approches techniques employées pour la détection de la distribution subcellulaire des protéines. Pour cette fin, j'ai développé une nouvelle approche quantitative de la fluorescence afin d'analyser de manière quantitative la distribution des protéines dans différents compartiments subcellulaires, incluant le noyau, le cytoplasme et l'enveloppe nucléaire (NE). Le développement de nouveaux outils afin de quantifier les niveaux de protéines dans divers endroits subcellulaires ouvre la voie vers la compréhension de l'organisation dynamique des différentes composantes cellulaires, ainsi que de la manière dont leur état dynamique régule leur fonction