Structural studies of lyase mediated resistance to group B streptogramins in «Staphylococcus aureus»

Abstract

Synercid® is used to treat infections caused by vancomycin resistant Enterococcus faecium, methicillin resistant Staphylococcus species and some Streptococcus species. It belongs to a class of antimicrobials, known as streptogramins, which is comprised of Group A (e.g. dalfopristin) and Group B (e.g. quinupristin) compounds. Independently, these compounds are bacteriostatic against Gram-positive bacteria, however, in combination they exhibit synergistic bactericidal effects due to permanent inhibition of the bacterial 50S ribosomal subunit. Resistance to the Group B streptogramins is conferred enzymatically by streptogramin B lyases (Vgb), which cleave the ring structure of these peptide drugs.Here we present the first crystal structure of a streptogramin B lyase from Staphylococcus aureus to a resolution of 1.65 Å. High-resolution data sets were collected for both the native and L-selenomethionine substituted Vgb and the structure was solved using a combination of MAD and molecular replacement techniques. The structure of Vgb, is that of a beta-propeller consisting of seven blades made of highly twisted beta-sheets arranged in a circular array. A similar fold has been observed in the WD40, Kelch, YWTD, PQQ and AxSPD families, however, Vgb has no sequence similarity to these proteins. This identifies Vgb as possessing a novel beta-propeller motif. Initial attempts to crystallize Vgb with a catalytically inactive mutant were met with limited success due to problems with crystal packing. Using structure-inspired loop mutagenesis, we were able to crystallize Vgb in a new crystal form conducive to substrate binding. This structure reveals that the antibiotic, quinupristin, binds in a large depression on the top face of Vgb. Guided by the structure, we propose a reaction mechanism in which the initial proton abstraction is facilitated by a Mg2+ linked conjugated system, with His270, His228, Try18, Glu268, and Glu284 playing roles in the catalytic mechanism. Since Mg2+ is only indirectly involved in the opening of the lactone ring, this represents a novel enzymatic mechanism.A comparison of Vgb and the ribosome structures reveals that Mg2+ facilitates the binding of the antibiotic through the 3-hydroxypicolinic acid moiety in both targets, however, the predominant associations are due to van der Waals interactions. In Vgb, interactions between the enzyme and the substrate are predominantly through interactions parallel to the plane of the lactone, while in the ribosome the antibiotic bound is at the periphery of the ring. This allows for extension of the antibiotic at the L-phenylglycine moiety when bound to the ribosome, while such an alteration would preclude efficient binding to Vgb. Lastly, we have characterized an engineered Group B streptogramin that has a variation at the L-phenylglycine position and we find that this new ligand retains antibacterial properties while it is a much weaker substrate for Vgb. This information has laid out the foundation
 for further structure-based drug design of Group B streptogramins that will bind the ribosome with greater affinity and not be susceptible to inactivation by Vgb.Le Synercide® est utilisé pour traiter les infections causées par Enterococcus faecium résistant à la vancomycine, les espèces de Staphylocoques résistantes à la méthicilline, ainsi que certaines espèces de Streptocoques. Il appartient à une catégorie d'antibiotiques dénommée streptogramines. Cette dernière est composée de deux sous-groupes d'antibiotiques, notamment Groupe A (ex. dalfopristine) et Groupe B (e.x. quinopristine). Utilisés indépendamment, ces composés ont un effet bactériostatique contre les bactéries à Gram positif. Cependant, en combinaison, elles exercent un effet synergique bactéricide grâce à l'inhibition permanente de l'unité 50S du ribosome. La résistance aux streptogramines du Groupe B est conférée par des enzymes lyases streptogramine B(Vgb), qui scindent la structure cyclique de ces antibiotique.Dans ce thèse, nous présentons la première structure cristallographique d'une lyase streptogramine B de Staphylococcus aureus à une résolution de 1.65 Å. Des données à haute résolution ont été obtenues pour la protéine Vgb native, ainsi que celle qui contenait des substitutions de L-sélénométhionine. La structure a été résolue en utilisant une combinaison des techniques de MAD et de remplacements moléculaires. La structure de Vgb est celle d'une hélice β composée de sept ailettes de feuillets β tordus et arrangés en formation circulaire. Un pli semblable fut observé dans les familles WD40, Kelch, YWTD, PQQ et AxSPD, cependant Vgb ne possède aucune similarité au niveau de sa séquence avec ces protéines. Ceci indique que Vgb possède une hélice β inédite. Les efforts initiaux pour cristalliser Vgb avec un mutant catalytiquement inactif ont été limités par des problèmes d'empaquetage de cristaux. En utilisant la mutagenèse d'une boucle, nous avons réussi à cristalliser Vgb dans une nouvelle configuration qui permet la liaison de son substrat. Cette structure révèle que la quinupristine se lie dans un large creux situé sur la surface supérieure de Vgb. Guidés par la structure, nous proposons un mécanisme de réaction dans lequel le départ initiale du proton est favorisée par un système conjugué lié au Mg2+, avec His270, His228, Tyr 18, Glu268 et Glu284 jouant des rôles clés dans le mécanisme catalytique. Étant donné que le Mg2+ est impliqué de manière indirecte dans l'ouverture de l'anneau du lactone, ceci représente un nouveau mécanisme enzymatique.En comparant Vgb et le ribosome, on observe que le Mg2+ favorise la liaison de l'antibiotique par le biais de l'acide 3-hydroxypicolinique aux deux sites, cependant, les interactions van der Waals représentent le mécanisme principal de liaison. Au niveau de Vgb, les interactions entre l'enzyme et son substrat sont favorisées par des interactions van der Waals parallèle au plan de la lactone, quant au ribosome, la liaison de l'antibiotique a lieu à la périphérie de l'anneau. Ceci permet l'extension de l'antibiotique sur la moitié L-phénylglycine lorsque lié au ribosome, mais un changement pareil empêcherait la liaison efficace à Vgb. Nous avons caractérisé une streptogramine B modifiée qui possède une variation à cette position et nous avons remarqué que cette nouvelle streptogramine garde son action antibactérienne tout en étant un faible substrat de Vgb. Cette information forme une base pour la création d'autres streptogramines de Groupe B qui se fixeront avec plus d'efficacité au ribosome sans être susceptibles à l'inactivation par Vgb