A p75NTR signaling cascade activates small GTPases to regulate cytoskeletal dynamics

Abstract

The p75 neurotrophin receptor (p75NTR) is a multifunctional receptor that conveys several physiological functions such as cell death and survival, neurite outgrowth, differentiation, and cell migration, and it is also implicated in many pathological conditions. p75NTR belongs to the tumor necrosis factor superfamily (TNFRs) and as all members of this family, p75NTR lacks an intrinsic catalytic activity and the diverse signaling pathways it transduces are due to its interaction with different cytosolic adaptor proteins. Signaling of p75NTR through Rho GTPases has been described in many different processes such as death of oligodendrocytes, myelination, as well as inhibition of neurite outgrowth in response to myelin inhibitory proteins. However, the link between p75NTR and Rho GTPases activation is not well defined, mainly due to the lack of a robust assay that allows the study of p75NTR signaling. In this work we used the COS7 spreading assay as a heterologous system to study the regulation of Rho GTPases downstream of p75NTR. This assay is widely used as a model to study growth cone dynamics in response to semaphorin signaling. We find that p75NTR mediates COS7 cell spreading on laminin through activation of Rac1 and that cleavage of p75NTR by ADAM17 and γ-secretase is an essential step in this process. We have previously identified NRAGE, a MAGE family adaptor protein, as a p75NTR interactor through which p75NTR induces cell death. Here we show that NRAGE acts downstream of p75NTR to mediate Rac1 activation and cytoskeletal rearrangement. To gain more insight on how NRAGE mediates the spreading effects downstream of p75NTR we performed a yeast two-hybrid screen and identified NEDD9, a Cas family member as a potent NRAGE interactor. NEDD9 is widely studied as a prometastatic factor acting downstream of integrins and focal adhesion kinase. Here we show that NEDD9 acts downstream of p75NTR to mediate Rac1 activation and cell spreading. Methods available for the measurement of Rho GTPases activity do not take into account subtle changes in Rho GTPases activation and underestimate the importance of the spatiotemporal changes in their activity. In order to study how p75NTR regulates the activation of Rho GTPases we took advantage of the Rho biosensors that allow the measurement of Rho GTPases activity through FRET. Using this method we find that p75NTR constitutively activates Rac1 but does not change RhoA activity although results show a trend towards a decrease in RhoA activation. Importantly, we show that this balance is altered when coreceptors such as NogoR1 and myelin inhibitory proteins such as Nogo66 are present. p75NTR has been shown to play an important role in cell migration and cancer metastasis. In particular, p75NTR is a potent mediator of glioma invasion in vitro and in vivo. Here we show that p75NTR is overexpressed in high grade human glioma, and that p75NTR increases migration of U87MG cells in vitro using the agarose drop assay which is a 2D migration assay on laminin, as well as by following the random motility of U87MG cells. Importantly, we show that cleavage of p75NTR is required for U87MG migration. However, NRAGE and NEDD9 act independently of p75NTR in this process, possibly through distinct pathways.In conclusion, this work defines a new pathway downstream of p75NTR in the regulation of Rac1 activation involving NRAGE and NEDD9 and that the role of p75NTR in Rho GTPases activation highly depends on coreceptors. Importantly, we show that p75NTR cleavage and the release of the p75ICD plays a crucial role in Rho GTPases signaling as well as glioma migration. Using the FRET bioassay it will be possible now to study the signaling mechanism linking p75NTR to Rho GTPases especially the role of GEFs or GAPs. It will also be important to investigate the relevance of the p75NTR-NRAGE-NEDD9-Rac1 pathway in physiological conditions.Le récepteur neurotrophique p75 (p75NTR) joue un rôle important dans plusieurs fonctions physiologiques telles que la mort, la survie, la différentiation, et la migration cellulaire, ainsi que la croissance des neurones. p75NTR contribue de même à différentes pathologies. Une des voies de transduction par laquelle p75NTR agit est par le biais des Rho GTPases. Ce phénomène est observé au cours de la mort des oligodendrocytes, la myélinisation, et la rétraction des neurones en réponse aux protéines inhibitrices de la myéline. Par contre, la régulation des Rho GTPases par p75NTR n'est pas complètement explorée, dûe en particulier à l'absence d'un modèle d'étude adéquat. Notre travail consiste en l'élaboration d'un système artificiel basé sur l'expansion des cellules COS7 sur laminine. Cette méthode est largement utilisée pour l'étude de la réponse du cône de croissance aux sémaphorines. Nous démontrons que p75NTR induit l'expansion des cellules COS7 via Rac1. Nous montrons aussi que p75NTR subit un double clivage par ADAM17 et γ-secretase résultant en la génération du domaine intracellulaire de la protéine (p75ICD), une étape essentielle dans l'activation de Rac1. NRAGE, membre de la famille des protéines adaptatrices MAGE, intéragit avec p75NTR et permet l'expansion des cellules COS7 ainsi que l'activation de Rac1. Un criblage à double hybride des levures nous a permis d'identifier NEDD9, membre de la famille des proteines adaptatrices Cas, comme interacteur de NRAGE. NEDD9 est un facteur prométastase qui fait partie de la voie de signalisation médiée par les intégrines. Notre travail démontre que p75NTR agit par le biais de NEDD9 pour induire l'expansion des cellules ainsi que l'activation de Rac1.Les méthodes disponibles pour la mesure de l'activité des Rho GTPases ne tiennent pas en compte les variations modestes de leur activation et sous-estiment l'importance de leur distribution celllaire. Nous avons utilisé les biocapteurs Rho GTPases qui permettent la mesure de leur activité par la méthode FRET. Par cette méthode nous montrons que p75NTR active Rac1 tandis que RhoA montre une faible tendance vers une diminution quoique non significative. Nous montrons aussi que l'activation des Rho GTPases par p75NTR est influencée par la présence de corécepteurs tels que NogoR1 et celle de protéines inhibitrices de la myéline.Etant donné le rôle de p75NTR dans la migration des cellules cancéreuses et en particulier des gliomes, nous avons examiné les signaux de transduction impliqués dans ce processus. Le taux de p75NTR est élevé dans les échantillons humains de gliomes de haut grade. Utilisant un modèle de migration à deux dimensions in vitro nous démontrons que p75NTR facilite la migration des cellules U87MG et que le clivage protéolitique de la protéine est essentiel dans ce processus. De même p75NTR augmente le mouvement cinétique spontané des cellules sur laminine. NRAGE et NEDD9 ne semblent pas directement impliqués dans la voie de signalisation de p75NTR dans ce processus.En conclusion, ce travail nous permet d'établir une nouvelle voie de transduction impliquant p75NTR-NRAGE-NEDD9 dans l'activation de Rac1. La régulation des Rho GTPases par p75NTR dépend largement de la présence de corécepteurs. Nous définissons un rôle majeur pour p75ICD pour l'activation des Rho GTPases et la migration des gliomes. La méthode FRET nous permettra de mieux comprendre comment p75NTR contrôle l'activation des Rho GTPases. Il serait aussi intéressant d'étudier l'importance de la cascade p75NTR-NRAGE-NEDD9-Rac1 dans un contexte physiologique