Telomerase and telomere regulation by associated proteins and in primary malignant lymphocytes

Abstract

Telomeres are repeated sequences of DNA at the ends of chromosomes that protect the cell from death. Telomerase is a ribonucleoprotein (RNP), consisting of a catalytic subunit, TERT, and an RNA component, TR, that synthesizes telomeres. Telomerase is active in 85% of cancers, including leukemias. Telomerase is thus a potential pharmacological drug target for cancer therapy, and it is important to understand this enzyme and its regulation by associated proteins. One goal of this thesis was to identify novel telomerase interacting partners that specifically regulate telomerase function and that could serve as potential anticancer targets. Additionally, it is important to understand how telomerase inhibition works in a cancer model. Telomere length is a prognostic factor in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Previous reports have assessed Imetelstat, a telomerase inhibitor which targets the human telomerase RNA component hTR, in a phase I-II clinical trial in CLL patients. We further investigated Imetelstat in lymphocytes from CLL patients. We found that telomerase activity was present in 47% of lymphocyte samples from CLL patients and that treatment with Imetelstat alone did not affect the survival of primary CLL lymphocytes in vitro. Nonetheless, Imetelstat increased the sensitivity of CLL lymphocytes to fludarabine, independent of basal telomerase activity. Imetelstat inhibited fludarabine-induced DNA-PK autophosphorylation, a surrogate of DNA-PK activity in CLL lymphocytes, to the same extent as the DNA-PK inhibitor NU7026. The effect of Imetelstat on fludarabine sensitivity was associated with a lower basal expression of the DNA-PK subunit protein Ku80. Our results suggest that Imetelstat can inhibit fludarabine-induced DNA-PK activity in primary CLL lymphocytes. We conclude that there may be a functional interaction between hTR and DNA-PKcs in primary CLL lymphocytes and that Imetelstat in combination with fludarabine may be useful to decrease the tumour burden in CLL. To investigate other telomerase targets, we identified telomerase associated proteins via mass spectrometry. One potential target is NOP17, which could be involved in the early assembly of telomerase. We created a human cell line stably expressing NOP17 fused to a FLAG tag. Telomerase activity was coimmunoprecipitated using an antibody against FLAG. Moreover, downregulating the expression of this Box C/D SnoRNP protein resulted in decreased telomerase activity. Characterization of telomerase-associated proteins is vital to our understanding of how this enzyme contributes to tumorigenesis. Understanding the regulation of telomere length and telomerase function by associated proteins will be important for the discovery of targeted therapeutics in cancers.La télomérase synthétise les séquences télomériques et se compose minimalement d'une sous-unité transcriptase inverse (TERT) et d'un fragment d'ARN (TR). La télomérase est active dans 85% des cancers, y compris la leucémie, elle représente donc une cible pour les thérapies du cancer. Afin de découvrir de meilleures cibles thérapeutiques, il est important de comprendre cette enzyme et sa régulation par des protéines associées. Un des buts de cette thèse est d'identifier de nouvelles protéines interagissant avec la télomérase, pouvant réguler ses fonctions de façon spécifique et ainsi potentiellement devenir des cibles anticancéreuses. De plus, il est important de bien comprendre l'effet de l'inhibition de la télomérase dans un modèle de cancer. Nous avons choisi la leucémie car la taille des télomères est un facteur pronostique de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). De précédentes études ont conduit à l'évaluation d'Imetelstat, un inhibiteur de la télomérase qui cible la composant ARN de l'enzyme, présentement en essais cliniques de phases I-II. Nos résultats montrent qu'il y a activité de la télomérase dans 47% des échantillons de lymphocytes de patients atteints de LLC et que le traitement seul d'Imetelstat n'a aucun effet sur la survie des lymphocytes primaires de LLC in vitro. Cependant, Imetelstat augmente la sensibilisation des lymphocytes à la Fludarabine, et ce indépendamment de l'activité basale de la télomérase. Imetelstat inhibe l'autophosphorylation de DNA-PK (l'autophosphorylation de DNA-PK est corrélée à son activité enzymatique dans les lymphocytes de LLC) induite par la fludarabine au même niveau que l'inhibiteur de DNA-PK NU7026. L'effet d'Imetelstat sur la sensibilité à la fludarabine est associé à l'expression basale de la protéine Ku80. Nos résultats suggèrent que l'Imetelstat inhibe l'activité DNA-PK dans les lymphocytes de LLC primaire. Nous pouvons conclure qu'il peut s'agir d'une interaction fonctionnelle entre hTR et DNA-PKcs dans les lymphocytes de LLC et que la combinaison de la fludarabine et d'Imetelstat pourrait être utile afin de diminuer la masse tumorale dans la LLC. Afin de découvrir de nouvelles cibles contre la télomérase, nous avons purifié le complexe de la télomérase par spectrométrie de masse. Cela nous a permis d'identifié une nouvelle protéine associée à la télomerase, NOP17, qui pourrait être impliquée dans l'assemblage de la télomérase. Nous avons créé une lignée cellulaire humaine exprimant de façon stable la protéine NOP17 fusionnée à une étiquette FLAG. L'Immunoprecipitation de NOP17 montre une activité de la télomérase indiquant qu'elle est associée à un complexe actif. Par ailleurs, la régulation négative de l'expression de la boîte C/D SnoRNP de la protéine réduit l'expression et l'activité de la télomérase. La caractérisation des protéines associées à la télomérase est essentielle afin de mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme ainsi que sont implication dans la formation de cancers. De plus, ces protéines associées à la télomérase pourraient également servir de cibles potentielles dans les thérapies contre le cancer