Functional analysis and applications of yeast expressed classical swine fever virus glycoprotein E[rns]

Abstract

豬瘟病毒（classical swine fever virus﹔CSFV）為豬瘟之病原，引起豬之高度傳染性疾病，並造成經濟上相當大的損失。而豬瘟病毒的結構蛋白包括有核蛋白C及3個封套醣蛋白分別是Erns、E1、E2，其中以Erns及E2主要可誘發宿主產生中和抗體。本實驗室在先前已利用酵母菌Pichia pastoris真核系統來表現Erns醣蛋白，並已確定其抗原性。因此本實驗則進一步大量表現Erns醣蛋白並進行其功能分析及其應用。首先先將含Erns表現蛋白的培養上清液進行硫酸銨沉澱，結果發現在硫酸銨最終濃度為40%即可將蛋白沉澱下來，並具有抗原性。再將此蛋白進行RNase之活性分析時發現不論是去醣基後（26 kDa）或是未去醣基的homodimer（74 kDa）及monomer（37 kDa）表現蛋白都具有RNase之活性可將PK-15細胞RNA降解。且將Erns醣蛋白分別與polyU、polyA、polyG、polyC、polyI/C等RNA polymer作用，則顯示polyU最具受質的特異性。而Erns表現蛋白經間接螢光抗體染色證實也能經由translocation方式進入細胞內。酵母菌表現之Erns醣蛋白亦可應用於西方墨點法（Western blotting）能識別感染野外豬瘟病毒株，及施打E2次單位疫苗之豬隻。此外，以酵母菌所表現豬瘟病毒醣蛋白Erns免疫BALB/c小白鼠後進行融合瘤實驗，經西方墨點法測定後篩選到一株融合瘤細胞能分泌特異性單株抗體，且能辨認感染細胞內病毒蛋白。以上這些結果皆顯示酵母菌所表現之Erns蛋白具有正確之蛋白結構與功能，將可提供作為豬瘟病毒致病機制之研究及發展成為診斷試劑之潛力。目錄 頁次 中文摘要-----------------------------------------------------Ⅰ 英文摘要-----------------------------------------------------Ⅱ 目錄---------------------------------------------------------Ⅲ 表次---------------------------------------------------------Ⅴ 圖次---------------------------------------------------------Ⅵ 第一章 緒言-------------------------------------------------1 第二章 文獻探討---------------------------------------------3 第一節 豬瘟之歷史背景-------------------------------------3 第二節 豬瘟病毒之特性-------------------------------------4 第三節 豬瘟病毒基因與蛋白之研究---------------------------4 第四節 豬瘟病毒之致病機轉---------------------------------7 第五節 豬瘟之臨床症狀及病理變化---------------------------8 第六節 豬瘟之流行病學-------------------------------------9 第七節 豬瘟病毒之研究現況---------------------------------9 第八節 豬瘟病毒之診斷------------------------------------10 第九節 嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris之特性及表現系統-------11 第三章 材料與方法------------------------------------------14 第一節 豬瘟病毒的Erns醣蛋白的大量製備----------------------14 第二節 酵母菌Pichia pastoris表現系統生產之Erns醣蛋白的純化-------17 第三節 RNase酵素活性之測定-------------------------------18 第四節 Erns表現蛋白之translocation測定-------------------20 第五節 豬隻血清Erns抗體檢測------------------------------21 第六節 融合瘤細胞之製備----------------------------------21 第四章 結果------------------------------------------------25 第五章 討論------------------------------------------------43 參考文獻-----------------------------------------------------4