台灣十字花科黑腐病菌偵測技術之研究

Abstract

本研究以選擇性培養基及血清反應探討由種子及土壤中偵測十字花科黑腐病菌Xanth- omonas campestros pv campestris （Xcc ）之技術。六種現有之選擇性培養基應用 於台灣，由十字花科種子流出液及土壤抽出液中偵測Xcc 時均不理想，其主要原因為 各培養基上出現雜菌及頡頏菌之數目偏多，影響回收效率，其中尤以modified SX 培 養基（DSK ）及mutrient starch cycloheximide agar（NSCA）表現最差。自種子及 土壤中常分離到對Xcc 生長具有抑制作用之頡頏細菌，這些頡頏細菌多屬於Bacillus spp 或螢光pseudomonads，前者在選擇性培養甚SM．SX或SCAA上無法生長，但後者之 多數菌系在SX上卻具有極強之抑制能力，嚴重影響Xcc 之回收，在SM及BSCAA 上抑制 力極微弱，尤其是在SM上。在SM中添加２５ppm 之cephalexin及nitrofurantoir能有 效去除種子上及土壤中之雜菌，而顯著提高回收Xcc 之效率，此種改良之SM培養基定 為starch methionine antibiotic medium （簡稱SMA ）。利用SMA 以種子洗出液償 測帶齒種子時，洗液以０．０１M 磷酸緩衝生理食鹽水中添加０．１％之Tween －８ ０（PBST）最理想，Xcc 在此液體中不但存活最久，而且其洗滌能力亦最強，種子加 入PBST洗液以１：２５（W／V）之比例加入三角瓶中，在試管振盪器１分鐘後，取洗 出之原液或濃縮液在SMA 上測試。依此步驟偵測人工污染Xcc 之種子時，靈敏度因種 子樣品不同而有所差異，最好時可偵測出０．０１％之帶菌種子。同樣驟應用於土壤 時（土壤與PBST以１：１０（W／V）比例混合），可偵測到Xcc 之最低菌量為每克土 壤含２．４×１０CFU 。以黑腐病菌XC３８菌系抗血清為材料，比較數種血清偵測 法時，間接免疫螢光法之靈敏度最高，可測出１．２×１０CFU ／ml之Xcc 菌量， 但專一性最差，雙層夾心式酵素抗體法專一性最高，僅X. campestris pv. vesicat- oria產生強的反應，但供試之６２個黑腐病菌系中有三個則成負反應。抗原細菌以添 加０．１％Tween ８０及０．１２５％glutaraldehyde磷酸緩衝生理食鹽水當作萃取 液萃取後，在雙層夾心式酵素連抗體法中反應最強，而背景呈色亦低，偵測同原抗原 細菌之靈敏度可達３．３×１０CFU ／ml，肉眼可判別反應則約在１．３×１０ －２．６×１０之間，此一方法同時亦適用於病組織中細菌之偵測。以雙層夾心式 酵連抗體法偵測帶Xcc 之種子或土壤，一般而言靈敏度不及以選擇性培養基SMA 之直 分離法，但其反應不受雜菌多寡之影響，在大量種子之偵測上亦不失為可行偵測法， 同時亦可輔助培養基直接分離法以確認可疑之菌落，也可應用於田間作物或雜草可疑 病徵之快速鑑定