近年來由於抗藥性細菌的出現，使得此公共衛生議題成為全球關注的焦點之一。諸多研究均提出，人類及動物可能經由食物鏈、直接或間接地接觸到彼此帶有抗藥性基因的細菌，使得抗藥性基因藉以互相的傳播，增加細菌間抗藥性的多樣性。在乳牛場中，大腸桿菌(Escherichia coli)為乳牛乳房炎、下痢、子宮感染、肺炎、膿腫及小牛臍帶炎等之常見病原，因此本研究希望藉由抗藥性型態及抗藥性基因盛行率之情形，來調查健康動物來源的大腸桿菌與牧場中常見疾病所分離出來的大腸桿菌之間的關係。本研究以抗生素敏感性試驗了解大腸桿菌的抗藥性以及利用多重引子聚合酶鏈鎖反應(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)方式，偵測牧場中較常使用的四環素抗生素的相關抗藥性基因tetA、tetB、tetC、tetD、tetE以及tetG。本研究共分離320株大腸桿菌，其中150株健康泌乳牛腸道來源的大腸桿菌、126株來自生乳樣本、33株來自下痢牛隻糞材、5株來自母牛產後子宮炎分泌物、2株來自仔牛臍帶炎病例、2株來自母牛膿腫病例及2株來自牛肺炎之肺臟病材。所挑選的13種抗生素中，抗藥性比例由高到低依序為oxytetracycline (42.5%)、tetracycline (38.4%)、amoxicillin (29.1%)、ampicillin (27.5%)與sulfamethoxazole/trimethoprim (20.9%)，而其中有27.5%的菌株具有多重抗藥性。生乳以及下痢樣本來源的大腸桿菌具有多重抗藥性菌株比例皆顯著高於健康泌乳牛腸道來源的菌株；而下痢樣本來源的菌株則顯著高於生乳樣本。Multiplex PCR檢測結果，顯示40.6%的大腸桿菌帶有四環素抗藥性基因，其中帶有tetA (23.4%)比例最高，其次是tetB (15.0%)、tetC (4.7%)以及tetD (0.6%)；帶有四環素抗藥性基因的菌株具有多重抗藥性的比例(53.5%)，顯著高於未帶有抗藥性基因的菌株(10.0%)。Antimicrobial resistance is a growing concern for public in recent decades. It had been showed that antimicrobial resistance isolates could be threats to human via direct or indirect contact and food chains. Escherichia coli is one of the most common pathogens which causes diseases such as mastitis, diarrhea, uterine infection, pneumonia, abscess, and omphalitis in dairy farms. The objective of this study was to invetigate the antimicrobial resistance and the prevelance of tetracycline resistance genes among E. coli isolated from healthy cattle and clinical cases in dairy farm by using antimicrobial susceptibility test and specific oligonucleotide primers for amplifying six genes: tetA, tetB, tetC, tetD, tetE, and tetG. In the result of this study, a total of 320 E. coli were obtained, including 150 enteric E. coli from healthy cattle, 126 E. coli from milk samples, 33 E. coli from diarrhea, 5 E. coli from uterine infection, 2 E. coli from omphalitis, 2 E. coli from abscess, and 2 E. coli from pneumonia cases. Among 13 antimicrobial agents tested, the resistance was most frequently examined for oxytetracycline (42.5%), tetracycline (38.4%), amoxicillin (29.1%), ampicillin (27.5%), and sulfamethoxazole/trimethoprim (20.9%). Multidrug resistance was noted in 27.5% of E. coli. The multidrug resistance was significantly higher in the isolates from milk and diarrhea samples than enteric isolates from healthy cattle; in addition, the isolates from diarrhea samples was significantly higher than the isolates from milk samples. The result of multiplex PCR revealed that 40.6% isolates containing at least one of the tet genes, and tetA (23.4%) was the most frequently identified among 320 E. coli; whereas tetB (15.0%), tetC (4.7%) and tetD (0.6%) were less. The multidrug resistance was significantly higher in the isolates containing tetracycline resistance genes (53.5%) than the isolates without containing tetracycline resistance genes (10.0%).摘要.......................................................i
Abstract..................................................ii
目次.....................................................iii
表次.....................................................vii
圖次....................................................viii
第一章 前言.............................................1
第二章 文獻探討.........................................2
第一節 大腸桿菌(E. coli)簡介............................2
一、 分類、型態與生化特性.............................2
二、 血清學分類.......................................2
三、 病原性大腸桿菌...................................3
(一) 致腸病性大腸桿菌(Enteropathogenic E. coli, EPEC).3
(二) 腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)..3
(三) 腸侵入性大腸桿菌(Enteroinvasive E. coli, EIEC)...3
(四) 腸附著性大腸桿菌(Enteroadherent E. coli, EAEC)...4
(五) 全面附著性大腸桿菌(Diffusely adherent E. coli, DAEE)......................................................4
(六) 腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E. coli, EHEC)或稱為產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing E. coli, STEC)......................................................4
第二節 抗生素之作用機制.................................5
一、 抗生素的歷史.....................................5
二、 抗生素的作用機制.................................5
(一) 抑制細菌細胞壁(Cell wall)的形成..................5
(二) 破壞細菌細胞膜(Cytoplasmic membrane)的功能.......5
(三) 抑制核酸(Nucleic acid)的合成或功能...............6
(四) 抑制細菌的蛋白質合成.............................6
三、 抗生素種類介紹...................................6
(一) 乙內醯胺類(β-lactams)...........................6
(二) 胺基配醣體類(Aminoglycosides)....................9
(三) 氟奎諾酮類(Fluoroquinolones)....................10
(四) 四環素類(Tetracyclines).........................11
四、 抗生素在乳牛場的使用情形........................11
五、 抗生素對農業及生態的影響........................15
第三節 細菌之抗藥性....................................16
一、 抗藥性菌株的產生................................16
二、 細菌抗藥性的監控................................17
三、 細菌產生抗藥性的機制............................17
(一) 細菌表現出抗藥性的原因..........................17
1. Intrinsic resistance............................17
2. Acquired resistance .............................18
(二) 細菌產生抗藥性的方式............................18
1. 產生破壞抗生素活性的酵素........................18
2. 抗生素作用位置修飾..............................18
3. 降低細胞內抗生素的濃度..........................19
4. 改變細菌代謝途徑................................19
四、 抗藥性基因的傳播................................19
(一) 載體............................................19
1. 質體(Plasmid)...................................20
2. 轉位子(Transposon)..............................20
3. 整合子(Integron)................................21
(二) 抗藥性基因的轉移方式............................21
1. 轉型作用(Transformation)........................21
2. 接合生殖(Conjugation)...........................22
3. 轉導作用(Transduction)..........................22
五、 多重抗藥性產生的機制............................22
第四節 四環素類抗生素(Tetracyclines)...................24
一、 四環素類抗生素的作用機制........................24
二、 四環素類抗生素的應用............................24
三、 四環素類抗生素抗藥性作用機制....................25
(一) 藥物排出機制(Efflux mechanism)..................25
(二) 核醣體保護機制(Ribosomal protection mechanism)..25
(三) 酵素性修飾機制(Enzymatic modification mechanism) 25
四、 四環素抗藥性基因................................26
第五節 大腸桿菌抗藥性之流行病學調查....................28
一、 臺灣牧場之大腸桿菌抗藥性........................28
二、 其他國家之家畜大腸桿菌抗藥性....................29
第三章 材料與方法......................................32
第一節 大腸桿菌菌株來源................................32
一、 採樣與培養......................................32
(一) 健康泌乳牛隻糞材採樣及培養......................32
(二) 生乳採樣及培養..................................32
(三) 下痢病例、膿腫病例、產後子宮炎、臍帶炎與肺炎病材之採樣與培養................................................33
二、 大腸桿菌之分離與鑑定............................33
三、 API® 20E生化鑑定................................34
四、 菌種保存........................................34
第二節 抗生素敏感性試驗................................35
第三節 以聚合酶鏈鎖反應偵測四環素抗藥性基因............36
一、 大腸桿菌DNA的萃取...............................36
二、 四環素抗藥性基因之多重引子聚合酶鏈鎖反應........36
(一) 基因引子........................................36
(二) 反應條件........................................37
(三) 電泳產物分析....................................38
(四) DNA序列解序.....................................38
第四節 多重抗藥性(multidrug resistance)菌株之定義......39
第五節 統計分析........................................39
第四章 結果............................................42
第一節 大腸桿菌分離結果................................42
第二節 大腸桿菌抗生素敏感性試驗檢測結果................43
一、 抗生素敏感性試驗結果............................43
二、 不同來源之大腸桿菌抗生素敏感性試驗之關係........47
(一) 健康泌乳牛腸道來源的大腸桿菌與生乳樣本、下痢、產後子宮炎、臍帶炎、膿腫及肺炎病例來源的大腸桿菌..............47
(二) 健康泌乳牛腸道來源的大腸桿菌與生乳樣本來源的大腸桿菌........................................................48
(三) 健康泌乳牛腸道來源的大腸桿菌與下痢樣本來源的大腸桿菌........................................................49
(四) 生乳樣本來源的大腸桿菌與下痢樣本來源的大腸桿菌..50
三、 抗藥性之分型....................................50
第三節 四環素抗藥性基因之檢測結果......................55
一、 tetA、tetB、tetC、tetD、tetE及tetG基因之偵測....55
二、 四環素抗藥性基因檢出與大腸桿菌菌株來源之關係....55
三、 四環素抗藥性基因之牧場分佈統計..................57
四、 四環素類藥物抗藥性表現型與基因型之關係..........59
五、 含四環素抗藥性基因菌株之抗藥性分型..............62
第五章 討論............................................65
一、 大腸桿菌抗藥性結果之探討........................65
二、 大腸桿菌抗藥性分型..............................68
三、 四環素抗藥性基因陽性率之比較....................69
四、 四環素抗藥性基因與牧場分佈統計之探討............70
五、 四環素類藥物抗藥性表現型與基因型之關係..........71
第六章 總結............................................72
參考文獻..................................................7
