Substratabhängige Aktivität und Diversität methanogener Archaeen in Sedimenten zweier Seen - ein jahreszeitlicher Vergleich

Abstract

Ungewöhnlich negative 13C-Signaturen von Chironomidenlarven in Seesedimenten wiesen auf biogenes Methan als bedeutende Kohlenstoffquelle ihrer Nahrung hin. Um die Basis der vermuteten Nahrungskette von Methan produzierenden Archaea über methanoxidierende Bakterien genauer zu untersuchen, wurden zwei morphologisch unterschiedlichen Seen hinsichtlich der Methanproduktion, -verfügbarkeit und -isotopensignatur sowie Diversität der Methanogenen verglichen. Der Große Binnensee ist ein polytropher, ungeschichteter Flachsee mit geringfügig marinem Einfluss und aerober Sedimentoberfläche; der Holzsee ein kleiner, eutropher See mit stabiler Schichtung im Sommer und währenddessen anoxischem Hypolimnion. Ungestörte Sedimentproben wurden im April, Juni und August genommen und in 3 Tiefenstufen aufgeteilt, deren potentielle Methanproduktion und Substratspektrum in Inkubationsexperimenten mit Substrat- und Hemmstoff-Zugaben untersucht wurde. Zusätzlich wurde es hinsichtlich chemischer und physikalischer Parameter charakterisiert. Von in vitro produziertem und in situ aufgefangenem Methan wurde die 13C-Signatur bestimmt. Mittels DNA-Extraktion, PCR-gestützter Amplifikation archaealer 16S-rRNA-Gene sowie des Methanogen-spezifischen MCRα-Gens und anschließender Allelauftrennung mit Denaturierender Gradienten-Gelelektrophorese wurde die Diversität methanogener Archaea im Seen- und Jahreszeiten-Vergleich nachvollzogen. Die Inkubationsexperimente ergaben durchgehend um ein vielfaches höhere Methanproduktionsraten in Holzsee-Sedimenten als in denen des Großen Binnensees. In beiden Seen war die Methanogenese substratlimitiert und konnte durch Zugabe von Acetat und mehr noch durch H2+CO2 stimuliert werden. Die Hemmstoff-Versuche legen für den Holzsee eine dominante Rolle von Acetat nahe, für den Großen Binnensee von H2+CO2. Methanol wurde in beiden Seesedimenten erst nach so langer Gewöhnungszeit zu Methan umgesetzt, dass es im Freiland kein wichtiges methanogenes Substrat zu sein scheint. Jahreszeitliche Schwankungen in beiden Seen waren geringer als Tiefenunterschiede, wobei Produktionsminima in der Regel in der untersten untersuchten Tiefe (12-20 cm) auftraten. Die Hauptunterschiede der beiden Sedimente lagen in deutlich höheren Sulfat- und Makronährstoff-Konzentrationen im Großen Binnensee, jedoch oberflächennah sehr viel geringeren Konzentrationen gelösten Methans. Acetat und andere Fettsäuren waren in beiden Seen nicht nachweisbar. Die Isotopenmessung von in vitro produzierten Methan ergab durchgängig negativere δ13C-Werte für den Holzsee als für den Großen Binnensee, während diese Unterschiede im in situ aufgefangenen Methan geringer ausfielen. Das DGGE-Bandenmuster des 16S-rRNA-Gens der Archaea war undeutlich und zeigte beim Großen Binnensee keine Tiefen- und nur schwache jahreszeitliche, beim Holzsee gar keineUnterschiede zwischen verschiedenen Proben. Die Diversität der MCRα-Allele war sehr gering: Im Großen Binnensee konnten jahreszeitenabhängig zwei verschiedene Banden, im Holzsee lediglich eine gefunden werden. Unusually depleted 13C signatures of Chironomid midge larvae in lake sediments indicated an important contribution of biogenic methane to their diet. To determine the basis of the suggested food chain from methane producing archaea via methane oxidising bacteria two morphologically different lakes were compared concerning their methane production, availability, isotopic signature and diversity of methanogens. Lake Großer Binnensee is a hypereutrophic, non-stratified shallow lake under slight marine influence having an aerobic sediment surface while Lake Holzsee is a small, eutrophic lake with stable stratification during summer and corresponding anoxic hypolimnion. Undisturbed sediment cores were taken in April, June, and August and divided into three depth layers. Through incubation experiments with addition of substrates or inhibitors their potential methane production and substrate spectrum was examined. Additionally, the sediment was characterised with respect to chemical and physical parameters. The 13C isotopic signature of methane trapped in situ and produced in vitro was determined. Diversity of methanogenic archaea in comparison between lakes and seasons was monitored via DNA extraction, PCR based amplification of archaeal 16S rRNA genes as well as the methanogen-specific MCRα genes followed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Incubation experiments resulted generally in higher rates of methane production in sediments of Holzsee compared to those of Großer Binnensee. Methanogenesis in sediments of both lakes was substrate-limited and could be stimulated by the addition of acetate and to, a greater extent, by hydrogen and carbon dioxide. Inhibitor experiments suggested for Holzsee a dominant role of acetate while for Großer Binnensee of hydrogen and carbon dioxide. Conversion of methanol to methane took such a long time in both lake sediments that it does not seem to be a significant methanogenic substrate in situ. Seasonal variation in both lakes was of less importance than differences between the depth layers, whereas methane production minima occurred usually in the deepest examined layer (12-20 cm). The main differences between the two sediments were a clearly higher sulphate and macronutrient concentration in Großer Binnensee, which, on the other hand, showed much lower methane concentrations near the sediment surface. Isotope measurements of methane produced in vitro resulted in consistently more negative δ13C values in Holzsee than in Großer Binnensee, while these differences were less pronounced in methane trapped in situ. The DGGE banding pattern of the archaeal 16S-rRNA gene was indistinct showing no depth and only weak seasonal differences in Großer Binnensee and no variation among different samples from Holzsee. Diversity of MCRα alleles was minimal: in Großer Binnensee two bands depending from season occurred while in Holzsee only one throughout the year.1 Einleitung 1 1.1 Methan in der Seen-Forschung 2 1.2 Methan als Kohlenstoffquelle in limnischen Nahrungsketten 2 1.3 Zielsetzung der Arbeit 3 2 Untersuchungsgebiet 4 3 Material und Methoden 7 3.1 Probenahmen 7 3.1.1 Entnahme der Sedimentkerne 7 3.1.2 Beprobung der Wassersäule 8 3.1.3 Auffangen von Gasblasen 8 3.2 Weiterverarbeitung der Sedimentproben 9 3.2.1 Aufteilen des Sedimentes in Tiefenstufen 9 3.2.2 Teilproben für Sulfat- und Fettsäurebestimmung 9 3.2.3 Gewinnung von Porenwasser aus Sediment 9 3.3 Bestimmung von potentiellen Methanproduktionsraten 10 3.3.1 Ansetzen des Hemmstoff-Substrat-Versuches 11 3.3.2 Gaschromatographische Messung 12 3.3.3 Berechnung der Methanproduktionsraten 12 3.4 Messung chemisch-physikalischer Parameter 15 3.4.1 Bestimmung von Trockengewicht und Glühverlust 15 3.4.2 Messung von gelöstem Methan 15 3.4.3 Messung der Fettsäuren- und Sulfatkonzentration 16 3.4.4 Messung von Phosphor- und Stickstoffverbindungen sowie gelöstem organischem Kohlenstoff 17 3.4.5 Isotopenmessungen in Gasproben 17 3.5 Molekularbiologische Untersuchungen 18 3.5.1 DNA-Extraktion 18 3.5.2 Agarose-Gelelektrophorese 19 3.5.3 Reinigung der DNA-Extrakte 20 3.5.4 Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) 20 3.5.5 Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE) 23 3.6 Statistische Auswertung 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Charakterisierung der Seen 26 4.1.1 Sauerstoff- u. Temperaturprofile, pH-Wert 26 4.1.2 Methankonzentration im Sediment 27 4.1.3 Sulfat 27 4.1.4 Phosphor- und Stickstoffverbindungen 30 4.1.5 Organischer Kohlenstoff 32 4.1.6 Fettsäuren 32 4.2 Methanproduktion und Substratpräferenzen 34 4.2.1 Großer Binnensee 34 4.2.2 Holzsee 37 4.3 Isotopensignatur von Methan und Kohlendioxid 41 4.4 Molekularbiologische Untersuchungen 44 4.4.1 Allelauftrennung des 16S-rRNA-Gens der Archaea 44 4.4.2 Allelauftrennung des MCR-Gens der Methanogenen 46 5 Diskussion 49 5.1 Einflussgrößen auf die Methanproduktion 49 5.1.1 Sauerstoffhaushalt der Seen 49 5.1.2 Makronährstoffe 49 5.1.3 Sulfat als alternativer Elektronenakzeptor 51 5.1.4 Organisches Material als Grundlage für methanogene Substrate 52 5.1.5 Acetat und H2+CO2, die wichtigsten Substrate der Methanogenese 53 5.1.6 Methanol 57 5.1.7 Temperatur 58 5.2 Verfügbarkeit von Methan in den Seesedimenten 59 5.3 Diversität 60 5.4 Methodische Anmerkungen und Anregungen 62 5.4.1 Messung physikalisch-chemischer Parameter 62 5.4.2 Molekularbiologisch Analysen 62 5.4.3 Hemmstoff-Substrat-Versuch 63 6 Zusammenfassung 66 7 Summary 68 8 Literaturverzeichnis 6