肠道菌群与艰难梭菌相互作用的研究苏文金（厦门大学生物学系）bOurlIOuXP（巴黎南大学药学院微生物学系）伪膜性结肠炎常见于服用抗生素的病人，其症状与厌氧的艰难梭菌（ClOSTrIdIuMdIffICIlE）及其毒素的作用有关，但其发病机制尚不清楚..

苏文金

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上海实验动物科学,一, 肠道菌群与艰难梭菌相互作用的研究苏文金厦门 大学生物 学系巴黎 南大学药学院微生物学系伪膜性结肠 炎常见于服用抗生素的病人,其症状与厌氧的艰难梭菌 忑 艺艺落“爪 公 艺坛 及其毒素的作用有关,但其发 病 机制尚不清楚。有作者怀疑 与抗生素疗法所 引起的肠道菌群平衡失调,致使艰难梭菌在肠道中定植 并产生毒素有关〔‘〕。由于动物肠 道 微 生 态系统细菌种类达几百种,菌数达 “,影 响 因素众多 的复杂性,难 以利用普通动物模型加 以验证。因此,  年代初,作者将一组仓鼠盲肠菌群移植至 系无菌小鼠,建 立了一个研究肠道菌群与艰难梭菌相互作 用的悉生动物模型,对与艰难梭菌相关的伪膜性结肠 炎进行了系统研究一 ’“’,试图阐明肠道菌群与外袭性细菌的相互作用机制,以期 了解抗生素疗法引起的伪膜性结肠炎的致病机理。屏障菌群的证 明与转移首先,验证了艰难梭菌在 系无菌小 鼠肠道中的定居和分布情况。在 接 种 艰难梭菌 菌株  后,就可在无菌动物肠道中定植下来,数量达 ℃ 粪便,并一直保持稳定。在 消化 道 中,胃 含量最低,小肠次之,盲肠最高 但在盲肠、大肠 和粪便之间,  密度的差 异 并 不 显著。因此,其数量分布也符合一 般 厌氧菌在正常动物肠道中的分布。这说明这一种动物可作为研究拮抗艰难梭菌的肠道菌群的实验动物模型。给 只成年普通仓鼠接种。接种后,其粪便中 含量从未超过 ’ 粪便。再将 同枯草杆菌嗜热 变 种 芽 抱 无 法在体内发芽繁殖而作为 目标菌正常通过肠道的标记物 一起接种于实验动 物,结 果 含量总是低于枯草杆菌芽抱含量,证明了普通仓鼠肠道中确实存在一可拮抗艰难梭菌定植的菌群。上述仓鼠经用乙 醚处死后,迅速送入无氧手套箱,在无氧条件下取出盲肠,做匀浆,稀释后立即送入 饲 养 周 龄 无 菌 小鼠的无菌隔离器 内,通过食道接种于无菌小鼠,周后受体小鼠接受 和枯草杆菌芽抱接种物 以验证屏障菌群是否已 在 受 体 小鼠中定植。结果表明,艰难梭菌无法在接受 仓鼠盲肠菌群的无菌小 鼠肠道中定植。屏障菌群贵任菌株的分离与鉴定植入受体小鼠的屏障菌群成分非常复杂,难以研究菌群与艰难梭菌的作用机制。因此,有必要简化该菌群成分。为此,作者先用抗生素 红霉素 只,通过饮用水 连续给药天 处理受体小鼠,除去了肠 内对 红 霉素敏感的细菌,特 别是大部分肠杆菌,但屏障作用仍得以保留。后将初步简化的屏 障 菌群加热 即取 出动物盲肠,在无氧手套箱中匀浆后放入安瓶瓶,密封,在 ℃水浴锅内加热,再植入新的无菌小鼠。细 菌定量分析表明,如此连续简化的菌群仅由厌氧菌组成,但仍可拮每通讯地址 厦门大学生物系,福建省厦门市 一 一抗艰难梭菌在肠道中的定植。这 表 明,厌氧 屏障菌群作用机制研究菌是拮抗艰难梭菌肠道定植 的 责 任 菌 株 表 关于体内细菌间相互作用机制存在着多种。假说,但由于肠道菌群成分的复杂性,皆未获此后,再用严格厌氧菌培养技术,作分离 得体内实验结果的证实。曾有学者认为挥发性菌群屏障责任菌株的尝试,但难度极大。另经 脂肪酸 特别是丁 酸 是抑制难艰梭菌肠道定植数年,终于从简化菌群中分离得到 株厌氧菌 的因素,但本文作者用含不同类型菌群的悉生菌株,其中有 株属于极端氧敏感细菌,株 动物及其他体外实验并未能重现这一结果。在属于严格厌氧菌。经鉴定,这 株菌株分别属 屏障功能不同 有些可绝对抑制艰 难 梭菌的肠于 艺、“ 才 落“水、乙 一 道定植,有些仅能部分抑市艰难梭 菌 的定植￡ 爪 艺、￡ 乞 艺。其中 的动物组中,其盲肠内含物 中 挥 发 性脂肪酸后 株 按 ￡ 乞 ￡ 乙、乙 艺￡ 乞 特另是丁 酸 的浓度差异并不显著。因此,单扭、切 顺序先后植入无菌 靠肠道厌氧菌产生的挥发性脂肪酸并不足以抑小鼠后,即构成一拮抗艰难梭菌肠道定植的屏 制艰难梭菌在肠道中的定植。障菌群,使艰难梭菌无法在三菌小 鼠肠道中定 在屏障菌群责任菌 株 的 体 内 研 究 中 发植,从而证明了严格厌氧菌是拮抗艰难梭菌肠 现,只有当 讯 首先在无菌小鼠肠道中道定植的责任菌株。定植后,乙 协。 才能定植,最后定植的表 不同动物粪便菌群的定且分析 细菌教士标准差 粪使,每组 只动物细菌种类厌氧菌总数好氧菌总数大肠埃希氏菌奇异变形菌耐氧链球菌乳杆菌艰难梭菌普通仓鼠菌群。土。。土。。土。士。。士。。士。。单菌小鼠菌群。士。受体小鼠菌群。士。。士。。土。。士。。土。。士。。士。。抗生素简化菌群 热简化菌群。士。 。士。。土。 。。 。。士。 。。士。 。。士。 。。 。甘甘是极端氧敏感细菌 ￡。因此,估计这些责任菌株的肠道定植与肠道微生态系统的营养、氧化还原电势和粘附位 点 等 因 素有关。为此,作者对这些菌株可能拥有的分解粘蛋白的酶组分进行了分析。体内外分析结果表明,首先在无菌小鼠肠道中定 植 的 “并不拥有降解粘蛋 白的酶系,无菌小鼠与结合认 “ 单菌小鼠粪便样品中的酶谱完全一致。不 扭 则拥有活性高、底物范围广的酶系,在体外可降解粘蛋白中的寡糖链,但不降解其中的多肤,而在结 合 认 拈、印 弓 批、的三菌小 鼠中,由于 乙 解 和 七 ￡ 印 的 协 同 作用,粪便中原有的糖蛋 白被降解并消失 了。并月,在 七咖 和 定植并保持其高数量后,衍 就 转变为三菌小鼠肠道菌群中的亚优势菌群成分。这些结果提示 讯 “ 首先定植的作用并不是提供扭、 肠道定植所需的来 自粘 蛋 白 的营养成分,而可能是修饰了肠道微生态系统中的氧化还原电势、p H 或使某些 C. coc 乙ea tu 机 定植所需的粘附位点得 以暴露出来,然后 c.’名耐of “和 c.co d ea tu 。 再联合作用,创造 了 极端氧敏感细菌 Eubac ter讯m sP 定植 所 需 的 厌氧环境,此后再 由 C.co e乙ea tu m 和 Eubacter ￡“m S p发挥对抗艰难梭菌肠道定植的菌群屏障作用。因此,屏障菌群与艰难梭菌相互作用的另一种可能机制是屏障菌群占据了艰难梭菌定植一 201一所需的同一粘附位点 (受体),或通过其酶系的作用,将粘蛋白降解,从而使艰难梭菌失去了在粘蛋 白上的粘附位点,或产生了可抑制艰难梭菌增殖的抑 (杀)菌物质。4.抗生家对屏障菌群的作用为了解抗生素对屏障菌 群 定 植 阻力的影响,选择 引起伪膜性结肠炎频率较高的氯林霉素 (C lin dam y ein ) 和用以治疗伪 膜 性 结 肠 炎的灭 滴 灵 (M etron idazole) 进行 实 验。将 12只结合有热处理简化屏 障菌群的悉生小鼠分成4组( 3只动物/组),并接受 以 下 处 理: 2.5m g 氯林霉素/只.d , 7 天 (第 1 组); i.g m g氯林霉素/只·d,4 周 (第 2 组); 1.O m g 灭滴灵/只·d,7 天(第 3 组);饮用水(对照实验,第 4 组)。给药结束后,动 物 经 口 植 入艰难梭菌 C dFD 菌株,以验证菌群屏障是否受破坏。结果表明,肠道菌群拮抗难艰梭菌定植屏障作用是否遭破坏与抗生素种类有关。氯林霉素处理会使动物暂时失去菌群屏 障作用,在接种 C dF D 后的第 1周,C d F D 菌数保持在 10“C F U/g 粪便的高水平,然后逐 渐 下 降。而灭滴灵处理组与对照组相同,C d F D 在接种后 48小 时内就下降到 10名C F U/g 粪便以下。在另一实验中,32 只悉生 小 鼠 分另lJ接受2 周的氯林霉素 (1.g m g /只·d,第 1组,共16 只 )、灭滴 灵 (1.o m g/只·d,第 2 组,共8 只 )和饮用水 (对照实验,第 3 组,共 8 只 ),再转移至两个不同的无菌隔离器,并分别接种C dF D (弱毒株 )和 V p l 10 463 (强毒株 )。此时,第 1 组动物又分成 2 小组,其中 1组在接受艰难梭菌接种物的同时还接受灭滴灵(1.o m g/只·天,第 1 组 B)。在艰难梭 菌 接 种 后 5、10、2 4 和 72 h 处 死 动 物,检查动物盲肠 内含物中的艰难梭菌菌数和细胞毒素滴度 (表 2 )。该实验除证实氯林霉素处理对菌群屏障的破坏作用外,还表明在艰难梭菌 菌 数 达一定 水平(> 10吕C F U/g 盲肠 内含物)时,可在 动 物盲肠中检测到细胞毒素,而在菌群屏障受氯林霉素破坏的情况下,灭滴 灵可抑制艰难梭菌的肠道定植 (如 C dFD )或将其抑制在一定的菌体水平,使其不能产生毒素 (如 V P I 10 46 3)。这些结果为灭滴灵对伪膜性结肠炎的治疗机制提供 了实表 2 抗生素处理的悉生小鼠盲肠内含物中的艰难梭菌菌数和细胞毒素滴度来接种 C dF D 后时间/h 接种 V PI 10463后时间/h5 1仃 24 7 2C d F D C T C d F D C T C d F D C T C d F D C T5 1 0 2 4 7 2C d V P I C T C d V P I C T C d V P I C T C d V P I C T10一874210s二一.30⋯48873410s二一.30⋯90876一.30⋯607了第 1组第 1组 B第 2组第 3 组8 。 5 2 一 9。6 58。3 2 一 7。8 71 028.2 6 1 02一 2。0 0 一6 。 9 36。3 0一 6。6 4一 5。1 81 028。0 8一 6。2 0一 4。1 83。8 6 一2 。 3 02。3 0‘C d F D 和 C dv PI:艰难梭菌菌数(19/g 盲肠内含物),C T:细胞毒素滴度多 一:未检出.验依据。动物盲肠中检测到艰难梭菌毒素; 停用抗生素5 . 关于抗生素疗法引发伪膜性结肠 炎 的 后,天然菌群屏障会逐渐 恢 复。根 据这些结假说 果,结合 已有文献报道,可 以假设:抗生素直上述研究结果 表明,以 作 用 于 厌 氧 菌 接作用于大肠 内正常菌群 (特别是其 中 的厌氧(肠道菌群的优势成份)的抗生素处理寄居有屏 菌成份 ),致使菌群屏 障失去作用。艰 难梭菌障菌群的无菌小鼠,可使动物丧失对艰难梭菌 虽以较小 比例存在于健康人的正常菌群内,并肠道定植的拮抗能力,使艰难梭菌在肠道中繁 且中断抗生素疗法,可使天然菌群屏障得 到恢殖和定值; 后者菌数达到一定水平时,还可在 复,但在停用药物和菌群屏障恢复之前的这段一 202 一时间里,原来受正常菌群或抗生素抑制的内源艰难梭菌,或从环境中乘虚而入 的外袭性艰难梭菌就容易在肠道中定植;如果定植 的艰难梭菌为强毒株的话,就有可能在短时间内诱发诸如伪膜性结肠炎之类的肠道疾病。中国的抗生素应用广泛,伪膜性结肠 炎之类的疾病也时有报道,应引起临床医生的重视。参 考 文 献1 Bartlett JG.CZos才r玄d 止u 矛” d 玄jf ie乞le: elin iealeon sid era tion.R ev In feet D is,1 9 9 0,1 2( S 即P1 2): 5 24 3一5 2 5 42 S u W J,B o u r加ud M,Be s nie rM oe 艺 a Z.T ra n s fe r o f h a m s te r eo e e a l flo r a to C 3 Hg e r m fr ee m ie e一 ut i l iz a t io n o f t h is mo delt o s t u d y t h e a n t i一C.d 玄ffie止le m ieroflo ra.M ieroeeol T h er,1 9 8 4,1 4:2 7 7 一2783 Su W J,Bo u rl io u xP,Bo u r n a ud Me t a Z.Tr a n sfe r t delaf lo r e e a e e a l e duhams t e r巨 la so u r is C 3 H a x 6 n iq u e: u tilis a t io n d ee e 们。o d 已le Pou r 毛tu d ier la flore d e b a rrj已rea吐卜C.d宕ff玄e 名乙e.C an J M iero bio l,1 9 8 6,3 2.1 3 2 一1 3 64 S u WJ,Wa e eh te rM J,B o u r l iouxP e t a 不.R o le of v olatile fatty aeid s in e o10 n izatio nresistan ee to C.d落打ie艺le in g n oto b iotiem iee.In feet Im m un,1 9 8 7,5 5:1 6 8 6 一1 6 9 15 苏文金.肠道菌群对艰难梭菌拮抗作用 的 动物模型研究.厦门吠学学报 (自然科学 版),1 9 8 8,2 7:5 7 8 一5 8 26 B o u r e a u H,De e r eD,PoPof f M已t a 乙.150 -latio n a n d id en tifiea tion of m iero flora re·s i s t a n t t o e o lo niz a t io nb y C.d 玄!I ie 玄葱已·Mie r o e e ol T he r,1 9 8 9,1 8:1 1 7 一1 2 07 B o u r l i o u x P,B o u r e a u H,Fo u r nia t Je t 盯.L es b arri已res an ti一C·d￡ff￡eile In:C.d ‘If卜e 云乙e assoe ia ted intestin al d iseases P a ris:S P rin g er一V e r l a g.1 9 9 0,9 5 一1 0 48 B o u r l ioux P,B o u r e a u H,SuWJ e t a l.I s o-leme n t e t i de n t i f ie a t io nde s s o u ehe s r e s P o n-s ab le sdela r 已sis ta n e e 盛 la eo lon isationP a r C。d 玄f!玄c葱不e su r un mod亡le e x P6 rim en-tal.M 己d M al In feet,1 9 9 0,2 0 ( ho r s s e rie):6 3 一 6 69 苏文金.抗生素在体内外对肠道厌氧菌的作用.厦门大学学报(自 然 科 学 版),1 9 9 0,2 9:2 2 3 一2 2 71 0 苏文金,B o u r l io u x p.对引入仓 鼠 菌 群的C 3 H 无菌小鼠拮抗艰难梭菌定居实验模型的研究.中国微生态学杂志,1 9 9 。,2(2 ):24-2 7n 苏文金,B ourlo u xP. 抗生素在体内外 对厌氧菌和艰难梭菌细胞毒素生成的作用.中国微生态学杂志,1 9 9 2,4 ( 2 ):4 一 91 2 B a re M C,DePi tr eC,Co r t h ie rGe 忿a乙.E f-feet of a n tib ioties an d o th er dr铭5 on to-x in Produetion in C·d 乞ff 玄e 云l已 in v i t r o a n di n v i v o.A n t im i e r o b A g e n t s C h e mo t h e r-1 9 9 2,3 6:1 3 3 2 一1 3 3 5一 203一

肠道菌群与艰难梭菌相互作用的研究

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