采用先通过 2 ,2′ 二硫二乙醇自组装得到自组装单分子层 (SAM) ,再在SAM上共价键合和吸附固定dnA的方法制备了两类dnA修饰电极 ,并对得到的dnA修饰电极进行了电化学和谱学表征 .结果表明该方法是可行的 ,也是较为理想的在电极表面固定dnA的方法 .国家自然科学基金!(批准号:39370213;39770220;29773034);厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室基金;湖北省自然科

庞代文

戴鸿平

施财辉

毛秉伟

程介克

胡深

蔡雄伟

陆琪

Science in China Series B-Chemistry Life Sciences & Earth Sciences (in Chinese)

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DNA修饰电极的研究＊——— Ⅶ .共价键合和吸附 DNA-SAM/Au修饰电极的制备及表征陆　琪　庞代文＊＊　胡　深　程介克(武汉大学化学学院 ,武汉 430072)蔡雄伟　施财辉　毛秉伟　戴鸿平(厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室 ,厦门 361005)摘要　　采用先通过 2 ,2′-二硫二乙醇自组装得到自组装单分子层(SAM),再在 SAM上共价键合和吸附固定 DNA的方法制备了两类 DNA修饰电极 ,并对得到的 DNA修饰电极进行了电化学和谱学表征.结果表明该方法是可行的 ,也是较为理想的在电极表面固定 DNA的方法.关键词　　DNA　修饰电极　自组装　制备　表征DNA修饰电极由于在基因传感器 、分子识别以及研究 DNA与其他分子的相互作用等方面有重要的科学意义和实用价值 ,因而正受到广泛关注[ 1 ～ 5] .DNA在电极表面的固定是 DNA修饰电极研究的基础.目前通过巯基(—SH)在Au表面自组装制备 DNA修饰电极的方法被广泛采用[ 3 ,5] .该方法是先将要固定的 DNA片断的一端修饰上 —SH ,再通过 —SH 在 Au表面的自组装作用得到 DNA修饰电极.但该修饰方法存在着一些问题 ,诸如—SH修饰的 DNA 难以合成 ,且需要分离提纯 ,操作繁琐 ,所以十分昂贵;巯基化合物结合 DNA后 ,其体积大幅度增加 ,因此在Au表面自组装比较困难.考虑到上述存在的问题 ,我们采用先进行 —SH化合物自组装 ,得到自组装单分子层(SAM),再在 SAM 上共价键合或吸附固定 DNA的方法制备 DNA 修饰电极 ,并对得到的 DNA修饰电极进行了电化学和谱学表征.1　材料与方法1.1　试剂小牛胸腺 DNA(华美生物制品公司)按文献 [ 6] 纯化至 OD260/OD280 值大于 1.8.Co(phen)3Cl2·8H2O按文献[ 7]的方法合成.2 ,2′-二硫二乙醇(DTDE ,Fluka), 1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDAC , Sigma),2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES , Serva),及其余所用试剂均为分析纯.实验用水为无菌二次蒸馏水.　　　1998-10-12收稿 , 1999-01-13收修改稿　　＊国家自然科学基金(批准号:39370213;39770220;29773034)、厦门大学固体表面物理化学国家重点实验室基金和湖北　　　省自然科学基金(批准号:96J037)资助项目　 ＊＊联系人　　　　　　　中　国　科　学(B　辑)　　　　　　 　第 29 卷　第 4期 SCIENCE IN CHINA(Series B)　 1999 年 8月1.2　dsDNA修饰电极的制备1.2.1　金电极的预处理　　金在沸腾的浓硝酸中浸煮5min ,取出后用水反复冲洗 ,在 1mol/LH2SO4中进行循环伏安扫描 ,扫描上下限分别是+1.5 , +0.2 V ,至得到稳定的循环伏安曲线.电极的真实面积根据表面氧化物还原峰的电量求得 ,为 1.20 cm2.经电化学处理和表征后的金电极 ,分别用水和丙酮超声清洗 5 min ,冲洗后立即放入含有 40μmol/L 的 DTDE 水溶液中 ,浸泡 4 h ,得到 DTDE修饰金电极(SAM/Au),冲洗备用.1.2.2　共价固定的 dsDNA修饰电极的制备　　将 SAM/Au转入含有 1 mg/mL 活化剂 EDAC和0.5 mg/mL双链DNA(dsDNA)的 0.04 mol/L MES-NaOH缓冲溶液(pH 6.0)中 ,室温下反应 24h.然后 ,取出电极 ,用MES缓冲溶液冲洗 ,水中浸泡 4 h ,得到共价固定的 dsDNA修饰SAM/Au电极 ,简记为(dsDNA)b-SAM/Au.dsDNA的共价固定是基于 SAM 表面的羟基与被 EDAC活化后的 dsDNA 5′-磷酸基缩合成磷酸酯而与 SAM键合.对照实验用修饰电极的制备方法相同 ,但 dsDNA的 MES-NaOH 缓冲溶液中不含 EDAC活化剂.1.2.3　吸附固定的 dsDNA修饰电极的制备　　SAM/Au在干燥器中干燥后 ,取 30 μL dsDNA ,均匀地铺展在电极上;于干燥器中放置过夜.取出 ,用MES缓冲溶液冲洗;在水中浸泡 4 h ,以除去未吸附的 dsDNA ,得到吸附固定的 dsDNA 修饰 SAM/Au电极 ,简记为(dsDNA)ad-SAM/Au.1.3　仪器与方法1.3.1　循环伏安(CV)　　实验在MCEC-II电化学与电分析测试系统(厦门大学化学系)上进行.实验采用三电极体系 ,以裸金电极或修饰金电极为工作电极 ,饱和甘汞电极(SCE)与铂丝分别作为参比电极和对照电极.试液为 5 mmol/L KNO3或含 10μmol/L Co(phen)3Cl2 的 5 mmol/LKNO3溶液 ,用高纯氮气除去溶解氧.实验在 25℃进行.1.3.2　X射线光电子能谱(XPS)　　XPS 实验以 dsDNA-SAM/Au为测试对象 ,采用 Mg 靶在VG ESCA-LAB MKII摄谱仪上进行.利用XPS-AES采集处理程序(版本 5.0 ,清华大学)采集处理数据.实验条件:射线源高压10 kV;射线源电流20mA;分析器模式 PE;倍增器高压2.9 kV;扫描次数 20.1.3.3　扫描隧道显微术(STM)　　采用 NanoscopeIIIa (Digital Instruments , Co.)在大气和室温下对样品表面进行直接观察 ,图象采集为恒电流方式.STM 所用针尖为电化学腐蚀的W丝.STM实验所用金(111)单晶按以下步骤制备:首先将一段直径为 0.8 mm的洁净金丝在氢/氧焰中灼烧直至形成 1个熔融的圆球 ,然后逐渐退火以缓慢结晶 ,最后得到 1个有 8个(111)单晶面的金球.其中一面即可用作修饰 dsDNA并进行 STM 观察的基底.2　结果与讨论2.1　2 , 2′-二硫二乙醇 SAM的表征2.1.1　电化学表征　　循环伏安扫描技术可用于考察 SAM 的性能1).其基本原则是将 SAM近似为理想平板电容器 ,由界面双电层电容判断 SAM 的厚度 ,介电性质和通透性.　　1)董献堆.自组装单分子层及其在生物电化学中的应用.武汉大学博士学位论文 , 1995342　 中　　国　　科　　学　　(B　辑) 第 29卷　　SAM修饰电极的界面双层电容 ,可由下式计算:C =Δi/(2vA), (1)式中 C为单位面积界面双层电容(μF/cm2);Δi 为电势 0.05 V处双层充放电电流绝对值之和图 1　SAM/Au 电极在 5 mmol/ L KNO3底液中的循环伏安图(μA);v 为扫描速率 V/s;A 为由 Au氧化物的还原峰确定的电极面积(cm2).实验结果表明 , 由于 DTDE 在 Au 表面的吸附 ,界面电容减小 ,并且吸附时间越长 ,界面电容越小 ,当吸附时间超过 4 h ,修饰电极的界面电容不再发生变化 ,说明 DTDE在 4 h内可吸附组装形成SAM ,得到稳定的 SAM/Au 电极.因此我们选择浸泡时间4 h为后续实验的条件.图1是 SAM 修饰 Au 电极在 5 mmol/L KNO3底液中的 CV行为 ,电势扫描范围-0.1 ～ +0.4V.界面双层电容为 7.8 μF/cm2.实验中发现当扫描上限超过+0.7 V ,修饰电极的电容会增大 ,表明 SAM在强电场的作用下会被破坏.2.1.2　STM表征　　图 2(a)为未修饰的Au(111)表面的STM图象(67 nm×67 nm),图 2(b)是在DTDE 溶液中浸泡 4 h 后 Au(111)表面的 STM 形貌(300 nm×300 nm).可见未修饰前Au(111)表面尽管分布有一定程度的缺陷(暗点所示 ,可能由化学处理过程引入),但整体上仍非常平坦.而经DTDE修饰后 ,可以清楚地看到形成了一层均匀 、致密的膜.如图 2(c)(50 nm×50 nm)所示 ,在更小的尺度范围内 ,可以更清楚地看到膜的结构.当然SAM也存在着少数缺陷(STM图中较暗的部分).缺陷的产生可能与Au(111)表面本身的缺陷有关.STM 的实验结果证实了DTDE确实在Au上形成了均匀的SAM ,这为进一步地修饰 dsDNA提供了一个极好的界面.图 2　不同电极表面的 STM 图象(a)Au(111)表面的 STM图象;(b)SAM/Au表面(300 nm×300 nm);(c)SAM/Au表面(50 nm×50 nm).隧道电流1～ 2 nA ,偏压 50mV第 4 期 陆　琪等:DNA修饰电极的研究——— Ⅶ 343　图 3　1×10-5 mol/L Co(phen)2+3 在不同电极上的CV 图1———SAM/Au , 2———(dsDNA)b-SAM/Au , 3———对照实验电极.底液:5 mmol/L KNO3 溶液;扫速:100 mV/ s2.2　(dsDNA)b-SAM/Au的表征2.2.1　电化学表征　　Co(phen)3+/2+3 已被证明与 dsDNA 有很强的相互作用[ 8] .因此 ,我们以Co(phen)3+/2+3 为指示剂来表征 dsDNA修饰电极.图 3中曲线 1是10μmol/L Co(phen)2+3 在SAM/Au上的 CV 图;图 3 中曲线 2 , 3 是在(dsDNA)b-SAM/Au及对照实验用修饰电极上得到的 CV图.根据上述 CV图得到的实验数据列于表1中.从表 1的数据中 ,可以看出 ,无 EDAC 存在时得到的电极对 Co(phen)3+/2+3 的响应电流比SAM/Au的稍有增大 , E0′负移 18 mV ,这表明在溶液状态且无偶联剂 EDAC 存在时 ,只有极少量的dsDNA在 SAM上产生吸附;而在 EDAC存在时得到的(dsDNA)b-SAM/Au 对 Co(phen)3+/2+3 的响应电流比SAM/Au的显著增大 , E0′负移 36 mV ,这是Co(phen)3+/2+3 与电极表面的 dsDNA相互作用的特征[ 4] .这说明在 EDAC存在下 ,绝大部分固定的 dsDNA是通过5′末端的磷酸基与SAM表面的羟基缩合成磷酸酯而共价键合到电极表面.表 1　在不同电极上得到的 Co(phen)3+/2+3 的电化学数据电极类型 E pa/V Epc/V ΔEp/mV E0′/V Ipa/μA Ipc/μASAM/Au 0.175 0.132 43 0.154 1.89 1.48(dsDNA)b-SAM/Au 0.130 0.107 23 0.118 4.00 5.00对照实验电极 0.161 0.111 50 0.136 2.02 2.08图4 　1 ×10-5 mol/ L Co(phen)2+3 的 5 mmol/ LKNO3溶液在(dsDNA)b-SAM/Au 上得到的 Ipc对 v及 v 1/2关系图曲线 1横坐标为 v1/2 ,单位:V1/2·s-1/2;曲线 2横坐标为v ,单位:V·s-1图 4是还原电流 Ipc对扫速 v 及v1/2的关系曲线 ,可以看到 Ipc既不与 v ,也不与 v1/2成线性 , Ipc-v1/2曲线向上弯曲 ,表明 Co(phen)3+/2+3 在电极上的电化学反应不单纯是由扩散控制 ,而同时存在表面过程 ,即在修饰电极表面存在富集效应[ 6].这从另一个侧面说明了 dsDNA 能被共价键合到电极表面.2.2.2　XPS 表征　　XPS是一种灵敏的表面元素分析方法 ,可以用 XPS 来表征 dsDNA 修饰电极.从基底SAM/Au的XPS谱图可知 ,在SAM/Au表面主要含有 C ,O ,S ,Au 等元素 ,未能检测出 N1s和P2p的信号.DNA的碱基和核糖-磷酸骨架中分别含有 N 和 P ,因此 XPS 谱中 N1s和 P2p信号是证明电极表面有无 DNA 存在的重要依据.通过比344　 中　　国　　科　　学　　(B　辑) 第 29卷图 5　(dsDNA)b-SAM/Au(曲线 1)和对照实验电极(曲线 2)的 P2p特征峰区的 XPS 谱图较不同样品的N1s或 P2p峰的峰面积可估算电极表面DNA覆盖量的相对大小[ 9] ,而 P 则是 DNA 存在的最有力的证据.图 5中曲线 1显示在 EDAC存在时得到的修饰电极即(dsDNA)b-SAM/Au 上P2p特征峰区的能谱曲线 ,可见出现了一较宽的 P2p峰.图5中曲线 2是对照实验电极在同样区域内的谱线 , P2p峰未出现.这一结果证实了在 EDAC存在时 dsDNA确实被共价键合到电极表面.由于对照实验电极表面仅存在少量吸附的 dsDNA ,以致观察不到 P2p的XPS信号.结合前面的电化学表征 ,我们不难看出 ,两者得出的结论是一致的 ,即 EDAC存在时 ,电极表面有高的 DNA 载量 , 绝大部分的 dsDNA 是通过EDAC的活化使5′末端的磷酸基与 SAM 表面的羟基缩合而共价修饰到电极表面.而对照电极仅有少量的 dsDNA吸附到 SAM/Au表面.(dsDNA)b-SAM/Au具有很高的稳定性.将该电极在 5 mmol/L的 KNO3 溶液中浸泡 24 h后 ,对 Co(phen)3+/2+3 的 CV响应电流与浸泡前完全一样.2.3　(dsDNA)ad-SAM/Au的表征2.3.1　电化学表征 　　与前述共价键合 dsDNA 修饰电极的电化学表征类似 ,表 2 列出了(dsDNA)ad-SAM/Au在 10 μmol/L Co(phen)2+3 中得到的 CV 数据.与 SAM/Au 上的相比 ,在(dsDNA)ad-SAM/Au上 Co(phen)3+/2+3 的响应电流显著增大 ,式电势 E0′负移 43 mV ,这表明dsDNA可通过干燥吸附方法[ 6]修饰到 SAM/Au电极上.表 2　在不同电极上得到的 Co(phen)3+/2+3 的电化学数据电极类型 E pa/V Epc/V ΔEp/mV E0′/V I pa/μA I pc/ μA Ipa/ IpcSAM/Au 0.175 0.132 43 0.154 1.89 1.48 1.28(dsDNA)ad-SAM/Au 0.133 0.090 43 0.111 7.89 10.00 0.79(dsDNA)b-SAM/Au 0.130 0.107 23 0.118 4.00 5.00 0.80Ipc对 v 及 v1/2的关系也与图 4类似 ,不成线性 ,同样也说明 dsDNA能被干燥吸附固定到电极表面.2.3.2　XPS表征　　图 6显示(dsDNA)ad-SAM/Au的P2p的特征峰区的XPS能谱峰.我们可以清楚地看到P2p的信号 ,表明dsDNA能通过干燥吸附方法固定到SAM上 ,得到(dsDNA)ad-SAM/Au修饰电极.2.3.3　STM表征　　对(dsDNA)ad-SAM/Au进行了STM观察(如图 7),与图 2(c)中的 SAM的STM相比有显著区别.图 2(c)中亮的部分十分集中 ,暗的部分较少 ,层次感不强 ,这正表明了DTDE形成了平整 ,均匀的SAM.而图7中亮的部分较为分散 ,暗的部分明显增多 ,亮暗分布较有规律.在与水平线成一定角度的方向上呈现一条条的亮区 ,有很强的层次感 ,这可能就是吸附的 dsDNA.由于 dsDNA之间存在静电斥力 ,使得SAM 表面上吸附的 dsDNA之间保持有一定第 4 期 陆　琪等:DNA修饰电极的研究——— Ⅶ 345　的距离 ,排列有序 ,分布均匀.进一步分析图 7的成象条件 ,对于已吸附有 dsDNA的 SAM/Au ,预计表面将较为疏松 ,导电性也将下降 ,故需使用较小的隧道电流和较大的隧道偏压才能得到清楚的STM图象 ,这也可用以支持 dsDNA确已吸附到 SAM/Au表面 ,且排列较有规律.图 6　(dsDNA)ad-SAM/Au 的 P2p特征峰区的 XPS谱图图7　(dsDNA)ad-SAM/ Au表面的STM图象(40 nm×40 nm)隧道电流:0.28 nA ,偏压:0.5 V与(dsDNA)b-SAM/Au的稳定性相比 ,(dsDNA)ad-SAM/Au的稳定性稍差 ,在5mmol/L的KNO3溶液中浸泡24 h后 ,再在Co(phen)2+3 溶液中进行CV扫描 ,得到的响应电流比浸泡前下降8%.dsDNA吸附修饰电极的稳定性比其共价键合修饰电极的差是可以理解的.2.4　(dsDNA)b-SAM/Au和(dsDNA)ad-SAM/Au修饰电极的比较比较在共价键合dsDNA修饰电极和吸附dsDNA修饰电极上得到的CV数据(见表2),我们不难发现两者的 Ipa/ Ipc都近似等于0.8 ,而与 SAM/Au上得到的结果(1.28)完全不同 ,说明 DNA的固定是成功的.但两种修饰方法得到的修饰电极在Co(phen)2+3 溶液中的电化学行为的区别也是显而易见的.由 ΔEp 可知 ,Co(phen)3+/2+3 在共价键合dsDNA修饰电极上反应的可逆性比在吸附dsDNA修饰电极上的要好.对于(dsDNA)b-SAM/Au ,由于 dsDNA是共价键合到 SAM上的 ,Co(phen)3+/2+3 与dsDNA结合后 ,可以通过具有电子传递功能的 dsDNA加快与电极间的电子交换速率[5] ,因而对Co(phen)3+/2+3 的氧化还原有好的可逆性 ,峰电势差小(ΔΕp=23 mV , 100 mV/ s).而根据吸附修饰dsDNA电极的表面结构 ,表面的dsDNA是通过化学吸附固定的 ,因而Co(phen)3+/2+3 不能通过dsDNA加快与电极表面的电子交换 ,因此其氧化还原可逆性(ΔEp=43 mV , 100 mV/ s)就不如在(dsDNA)b-SAM/Au上的好 ,而与在SAM/Au上的可逆性相似.SAM上共价键合dsDNA与吸附固定dsDNA制备 dsDNA修饰电极方法各有优点 ,前者得到的电极稳定性高 ,表面结构有序 ,而后者 DNA用量较小 ,DNA的载量高 ,两种方法都有其各自的应用前景.SAM上吸附或共价键合修饰 DNA与直接在电极表面吸附或活化后共价键合相比 ,有如下优346　 中　　国　　科　　学　　(B　辑) 第 29卷点.1)由于SAM的结构特点 ,使其为DNA的固定提供了一个稳定 、均一 、反应位点多的理想表面 ,并可根据不同的需要 ,提供不同官能团的表面[ 10] .2)SAM使 DNA和可能与DNA相互作用的生物物质避免与电极表面的直接接触 ,从而可以防止可能发生的变性.3)利用 SAM 对电极的封闭作用 ,可以消除由吸附产生的对金属电极的毒化.所有这些优点使得本文所采用的修饰方法将有可能在基因传感器 、DNA与其他分子的相互作用、以及DNA识别分析中得到应用.3　结论采用在金表面先修饰2 ,2′-二硫二乙醇SAM ,再共价键合和吸附固定 dsDNA分别得到了两类不同的 dsDNA修饰金电极 ,并对修饰电极进行了电化学和谱学表征.结果表明该方法是可靠和较理想的 DNA修饰电极的制备方法.制备的DNA修饰电极将在电化学基因传感器和DNA与其他分子的相互作用研究等方面有应用前景.致谢　实验工作得到厦门大学分析测试中心王水菊老师的大力支持 ,谨致谢忱.参　　考　　文　　献1　Mikkelsen S R.Electrochemical biosensors for DNA sequence detection.Electroanalysis , 1996, 8(1):152　Xu X H , Bard A J.Immobilization and hybridization of DNA on an aluminum (III)alkanebisphosphonate thin-film with electrogeneratedchemiluminescent detection.J Am Chem Soc , 1995, 117(9):2 6273　Hashimoto K , Ito K , Ishimori Y.Sequence-specific gene detection with a gold electrode modified with DNA probes and an electrochemicallyactive dye.Anal Chem , 1994, 66:3 8304　Pang D W, Abruña HD.Micromethod for the investigation of the interactions betweenDNA and redoxactive molecules.AnalChem , 1998, 70:3 1625　Kelley S O , Barton J K , Jackson N M , et al.Electrochemist ry of methylene blue bound to a DNA-modified 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DNA修饰电极的研究——Ⅶ.共价键合和吸附DNA-SAM/Au修饰电极的制备及表征

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