一前言高效液相色谱(HPlC)是现代发展速度最快的分离分析方法之一。反相高液相色谱(rP-HPlC)是各种HPlC形式和方法中应用最广的形式和方法。因此,对其保留机理的研究有更重要的意义

刘文远

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1 9 9 6,5 (4 ) 福建分析测试 5 2 9综 述反相高效液相色谱保留机理研究刘文远(厦门大学化学系,国家教委分析科学开放实验室,厦门 3 6 1 0 0 5)一 前 言高效液相色谱 (H P LC )是现代发展速度最快的分离分析方法之一。反相高液相色谱 (R P-H PL C) 是各种 H PL C 形式和方法中应用最广的形式和方法。因此,对其保留机理的研究有更重要的意义。在反相固定相的研究中,二氧化硅的表面处理方法和官能基结合反应的控制方法的成功以及高重现性保留的固定相的开发促进了对固定相的进一步研究。与此同时,对流动相组成与溶质保留的相互影响,溶质本身的结构和性质与保留的关系,也有了一些新的认识。反相高效液相色谱在有机物分离分析方面已有广泛应用,近年来,在生物高分子,例如蛋白质方面,也有许多成功的研究和应用。R P一H PL C 在无机物分离分析中也取得一些成效和进展。近年来,山本文子、谷和江、D or s ey、S n yder等在 R P一H PL C 的保留机理方面已有一些评述,本文将在此基础上对上述问题的进展做一些介绍。二 反相固定相的几种模式反相高效液相色谱里,溶质在柱里保留是由于分配或 由于吸附至今仍有争论。问题在于把固定相看成什么样子的相。有的模式认为固定相是在二氧化硅表面结合有的烷基链是坚硬的棒。而根据 M ar tire等的模式,则认为固定相的结构与液晶相似,认为固定相上面烷基是“会摇动的链” 。其两端被固体和流动相膜所固定。Di n 则提倡接 口模式,认为固定相是由烷基链形式的,固定相烷基链之间不含溶剂,其性质随相的深度而变化。B Oh m e r 则认为固定相乃烷基链和把其溶剂化的溶剂层组成的相,溶质的保留乃溶质埋入于烷基链之间。三 固定相的结构与溶质的保留实验观察到的异常解析为由于固定相的相转移引起的。固定相的相转移像玻璃那样。功能基密度越大,相转移温度越高,功能基越长,相转移温度越高。相转移温度影响相结构。固定相分单体状相和聚合物状相。柱温 比相转移温度高时,固定相的烷基链处在比较易动的状态,用更强的溶剂为流动相对,溶质插入于烷基链之间而保留,这是“插入”机理。在相转移温度以下,溶质分子被浸于固定相 内而保留,这是分配机理。单体状相和聚合物状相在一定条件之下会可逆地转化,则保留机理会由分配型向吸附型转化,或反之。5 3 0 福建分析测试 综述 1 9 9 6,5 (4 )四 流动相的组成和溶质的保留甲醇和乙腊是反相高效液相色谱常用的溶剂,但它们用作流动相的特性十分不同。一般地说乙睛一水是 比甲醇一水更强的溶剂。但是,在纯溶剂或水含量很少时则相反。乙腊作流动相有特异性。乙睛在水量少时会产生簇状物,影响保留。向流动相添加某些溶剂例如醇类,可改变流动相的性质和固定相的性质,改进保留以达分离目的。五 溶质的结构与保留T c ha p la 等研究相转移温度以上用单体状固定相对各种同系物的保留有一个 S 形的关系曲线。其转折点分别为临界碳数和饱和碳数。溶质的碳数 比临界碳数小时,保留值随固定相烷基链和接触能的增加而增加,这种保留属吸附型。如溶质的碳数在临界碳数和饱和碳数之,则表现为分配型。如溶质的碳数比饱和碳数为大,则保留乃靠和末端部的烷基链相互作、无机物的保留机理较早研究和较广使用的二乙氨基二硫代甲酸盐用于许多金属离子的分离。在 C18 、C:固定间用、相 上分配保留。试剂和其金属络合物在水性流动相中的低溶解度是其缺点,可在流动相加C HCI。来解决。试剂被氧化问题可藉加还原剂于流动相和事先防止氧化的措施来改善。三元混合溶剂流动相可能产生尖锐的分辨好的峰。加试剂于流动相可抑制金属络合物的电离,改善保留。反相柱固定相用离子对试剂修饰可大幅度改变固定相的性质而广泛应用于各种无机物的分离分析。离子对试剂为长链阳离子或阴离子,以永久涂复或动态涂复两种形式修饰固定相。我们用 8一羚基唆琳一5一磺酸 (HZQ S)、E D T A 和金属离子的三元荧光络合物分离 Sn 、 G a、Z r 离子时便是用澳化四丁基铁动态涂复于反相固定相,Z r 形成 Zr 一HZQ S一E D T A 三元荧光络合物阴离子,该络阴离子与固定相上的 Br一交换而保留于柱上而与 Sn 、 G a 及其它金属离子分离。用类似的方法可分离许多无机阴离子。分离的选择性通过有机改进剂、酸度、配位基浓度来调节。七 蛋白质的保留H PL C 在蛋白质分离纯化方面有很大的发展。考虑到蛋白质是高分子物质,体积较大,使用多孔性固定相常出现峰形不好、分离时间较长、回收度和活性回收率低等缺点。为此,人们便用大孔 (如 3 0 人,5 0 人) 的固定相。如使孔径达 1 0 0 0人,则可克服上述缺点。但这样的固定相机械强度不足。鉴于多孔性填充剂有上述问题,人们开发了微表面多孔型填充剂 (非多孔性 ),例如用 sc m 长 4.6m m 内径的这种C 1 8柱,可在高温 (80 ℃ ) 大流量 (sm L / m in) 乙睛一水线性梯度淋 30 秒钟超高速分离 5 种蛋白质。V an DerZee等研究了不同厂家生产的 9 种商品反相固定相 (CI。、CS 、C4 、Cl 、苯基、睛基,其中 C18有一种是普通反相柱,并非专供蛋白质分离用) 用于蛋白质分离。研究表明,分辨率与烃类配位基的特殊类型无相关关系; 乙睛一三氟乙酸流动相对简单水可溶蛋白质的分辨率较好。1 9 96,5 (4 ) 福建分析测试 5 3 1在蛋白质分离中有些人感到蛋 白质的保留有“怪癖” 。用一种流动相洗不出来,稍为增大溶剂的含量,却一下子就淋洗出来。因而有人提出“开关”机理或“临界行为”机理。这两种机理只说明现象,未能说明保留的本质。Ju ni o hi K oya m a 等通过精密的等强度淋洗实验,清楚地表明在等强度的条件下,高分子化合物 (蛋白质) 表现出与低分子量化合物相似的淋洗性能,即较长的柱会得到较长的保留时间和较高的理论板数。他们还试验了流动相乙睛浓度变化对 K’值的影响,结果表明蛋白质的行为与小分子物质相似,只是蛋白质 K‘值随乙睛浓度的改变大得多罢了。为此,他们支持 Sny der等的观点,认为在有机溶剂浓度未达低限时蛋白质K‘值很大,在柱中移动很慢,而在有机溶剂浓度稍为超过低限时,W K‘变得小,柱保留小,蛋 白质通过柱,反复分配于固定相。待有机溶剂浓度达上限,蛋白质 K‘变得很小,很快淋出。八 其它物理、化学方法研究上面讨论固定相时,是 以色谱保留行为为基础 的,所得有关信息是间接的,难以避免含有推论。因此人们也通过光学仪器等方法直接观测固定相。例如用小角度中子散射法测定在甲醇中单体状 Cl。相的厚度为 1.7n m,聚合物状 Cl :固定相厚度为 2.In m。考虑到 18 烷的长度为 2.3n m,认为在甲醇中固定相烷基链以弯曲的几分无秩序的状态存在。又如加荧光试剂于水中在固定相表面聚集,表现烷基链在表面上以 75。角存在。又如测定某橙色物质在 C: 。和水界面的扩散常数比在水中小 35 倍,表现出烷基链在水中动得慢。有人用 N M R 数据解析了乙睛溶剂中Cl。固定相溶剂的粘性。有人用 NM R 研究了乙睛和甲醇作为溶剂特性的不同,乙睛分子间进行疏水性集合,比甲醇能和烷基链更好地溶剂化。用 N M R 可直接观测固定相的官能基。把 N M R 得到的证据和从色谱保留研究得到的推测、结论结合起来是更重要的。当代计算机技术在科技各领域无孔不入,有一些人用计算机模拟对保留有关问题进行分子动力学模拟研究,建立了一些膜模式,但和实际色谱得到的相差较大。Kl at te 等成功地建立了 C。模式,显示出 CS固定相在低温是无秩序的玻璃状态,随着温度增高,烷基链的运动性增大,到 3 0 0 K 则疑似液体状态,与实际色谱相近,人们期待着这方面有较大的进展。

反相高效液相色谱保留机理研究

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