四环素类抗菌素的碱性溶液(kOH)在沸水浴中加热一定时间而发生降解,其降解物的荧光激发光谱和发射光谱均发生改变,且荧光强度较四环素类抗菌素本身的天然荧光增强5~190倍,认为发生了分子内亲核断环反应,生成具有内酯结构的降解物,此降解物内酯结构中氧原子上孤对电子与共轭π电子相互作用.使分子中共轭电子体系的离域性增大,荧光增强.国家自然科学基金;福建省自然科学基金资助项

常文保

慈云祥

赵一兵

Science in China Series B-Chemistry (in Chinese)

Xiamen University Institutional Repository

第 2 7卷 第 3期申 旧 种 幸( B辑 )S CI I C E E N NCH I NA(S eri es B)9 9 1 7年 6月四环素类抗菌素碱性降解荧光增敏作用研究关赵一兵( 厦门大学化学系,国家教育委员会材料和生命过程分析科学 开放研究实验室,厦门 3 61 0 0 5)慈云祥 常文保(北京大学化学 系,北京 10 0 5 7 1 )摘要 四 环素类抗菌紊的碱性溶液 ( K O H )在沸水浴 中加 热一 定时间而 发生降解,其 降解物的荧光激发光谱和发射光谱均发生改变,且 荧光强度较 四 环 素类抗菌 素本身的天然荧光增强 5 一 19 0 倍,认为发生了分子 内亲核断环反应,生成具有内醋结构的降解物,此降解物内醋结构中氧原子上孤对 电子与共扼二 电子相互 作用.使分子中共轨电子体系的离域性增大,荧光增强.关镇词 四环紊类抗菌素 碱性降解 荧光法近年来,`荧光分析法在药物分析和生物活性分子分析方面取得 了进展 〔’·“ 〕 , 在与其他仪器分析方法联用方面,如高效毛细管电泳一荧光检测和高效液相色谱一荧光检测等 [3 一 5 ],也取得了成果.目前,就荧光法本身来讲,以提高方法灵敏度和选择性为目的的研究较多,相应的荧光光谱理论研究则较少.分子的荧光,是由于其吸光结构在吸收光线之后所产生的,它的强度和该分子的吸光能力和量子产率有关.分子的荧光激发光谱形状与其吸收光谱相应部分的形状相对应,而且后者与分子的结构密切相关.分子吸光后的激发态电子释放能量的方式有多种,因此,能产生吸收的物质不一定产生荧光,而产生荧光的物质必然先产生吸收.分子荧光光谱的一种情况发生在具有二电子共扼结构的体系中,而且随着7t电子共扼体系的增长,离域二电子越容易激发,荧光强度增大.常用的增加灵敏度的方法为引入其他物质的金属离子络合增敏和荧光标记增敏等〔6一 9 ],而对于物质自身发生衍生化反应的荧光增敏现象的研究不多,而且主要集中在光化学荧光衍生化方面 〔̀“ ].我们的研究结果表明,通过有机药物自身的降解作用可以建立一些药物的灵敏度高、选择性好的荧光分析方法,据此进行了相应反应的荧光增敏作用研究本文报道了四环素类抗菌素 ( T Cs )碱性降解物的荧光增强与降解物结构的关系,首次阐明了分子中内酷结构对荧光的增敏作用.通过对降解物结构和分子 内共扼体系的研究,确证19 96一0 4、12 收稿.19 9 6一0 9一2 9 收修改稿,国家自然科学墓金和福建省自然科学荃金资助项 目第 3期 赵 一兵等:四环素类抗菌素碱性降解荧光增敏作用研究了四环素( TC )、金霉素 ( C TC )和土霉素( O TC )的亲核断环机理,并提 出了 甲烯土霉素 ( M )C 和强力霉素 ( D )C 的碱性降解机理.1 实验部分1.1 仪器日立 8 50一10 5 荧光分光光度计,激发和发射单色器狭缝均为 5n m,1 。 m 石英液池,各自空白为参比溶液.岛津 u v一3 0 型紫外一可见分光光度计 ; o ir on s n 型 p H 计.1.2 试荆四环素类抗菌素:卫生部药品生物制品检定所,层析标准品.其他试剂均为分析纯试剂,水为去离子水.1.3 降解方法四环素类抗菌素的 K O H 溶液在沸水浴中加热形成其碱性降解物,所需碱浓度分别为:T C,0.3 0 m o l / L ; C T C,0.0 5 mo l / L; O T C,0.1 0 m o l / L ; D〔:,0.0 5 m o l / L 和 M C,0.0 5 m o l / L.完全降解所需时间分别为: T e,2 0 m i n,e T e 5 m i n ; o T C,10 m in ; M C,3 0 m i n ; oc 3 0 mi n.降解产物在相应的仪器条件下测定荧光光谱.2 结果与讨论四环素类的化学结构上,都具有氢化并四苯环,而且都具有广谱抗菌能力,故统称为四环素类抗菌素 ( T Cs ).常见的有 T C,C T C,O T C,M C 和 D C,它们都有下面的基本结构 (如图 1 ).尸 一 一 一 一 一 一 一 一 刁! R,R,R , R.!( C H3): 结构中符号列表如下凡丽oOH、右.一Hx一C厂一一 一 一 一 一 一 n 凡`T sCHHOHHCI0 HC O N H z1 O H 0 0 H}一 一 _ _ _ _ _ _ J红 2 _ _ _ _ _ _ J H ’ “ C线 …四环索金 . 家土 . 索强力 . 素甲烯土 . 索图 l 四环素类抗菌素结构T cs 的紫外一可见吸收光谱在 2 75n m 和 3 80n m 左右显示两个强吸收峰,从分子结构上看,它们都有两个独立的共扼体系,这两个共扼体系都是含有酮基的不饱和体系,根据陈国珍介绍的经验规则 [川,可以大致计算出这两个共扼体系的最大吸收波长.将共扼体系 I 看做不饱和烯酮体系,将苯环作延伸双键处理,同时考虑成环的Q 取代,则最大吸收波长为:又m a : = 2 1 5 n m + 2 x 3 o n m (延伸双键 ) + 2 x sn m (环外双键 ) + 2 x l on m ( 。 取代烷基 ) +Z X 12 n m ( p取代烷基 ) + Z x 3 0n m ( p取代 O H ) 一 sn m (溶剂校正 ) = 3 5一n m共扼体系 n 为 p二酮体系,将其中的酞胺基作延伸双键处理,则 :几nBI: = 21 5 mn十 30 mn (延伸双键 )+ 12 mn ( p取代烷基 )+ 30 mn ( p取代 oH )一 s ln (溶剂校正 )二2 7 9 n m中 国 科 学 ( B辑 ) 第 27 卷比较 TCs 吸收光谱中 27 5和 38 0nm 左右的两处强吸收,可认为 2 75n m 处的吸收为共扼体系 1 吸光所致,而 3 8 0 n m 处的吸收为共扼体系 工吸光所致.表 l 列出了四环素类抗菌素天然荧光及其碱性降解物荧光的激发和发射波长的实验值,表 1 T sC 及其降解物的荧光激发和发射波长天然荧光 /n m 降解物荧光 /n mT Cs— —人。 :风。二 人。 人.二T C 3 7 9.4 5 19.0 3 3 3.1 4 16.0C T C 3 8 5.6 52 4.2 3 4 5.1 4 19.2( )产r C 3 7 3.6 5 16.4 3 3 4.1 4 16.2M C 3 8 2.9 52 7.6 3 8 0.3 4 9 6.9I) C 3 7 8.2 52 2.6 3 7 4.6 4 9 0.1由于有机物荧光激发波长与其吸收波长相对应,而四环素类抗菌素天然荧光的激发波长与按经验规则计算的共扼体系 工的吸收波长值和实验值几乎一样,与共扼体系 n 的吸收波长值相差很远,因此可以认为四环素类抗菌素的天然荧光是由于共扼体系工吸光后发光所致,而与共扼体系 n 无关.金霉素分子苯环上 C l原子的未成键电子的 p一二共扼作用,以及甲烯土霉素分子中增加的共扼键数 目,使它们的荧光激发波长明显地 比其他几个稍长一些.T C s 在碱性条件下,降解产生强荧光化合物,其中 C T C 在室温放置即可降解,而其他几种抗菌素需沸水浴加热才能降解.根据 T Cs降解物荧光激发和发射波长 (表 1) 可以把这些抗菌素分为两类:T C,C T C 和 O T C 为一类工( : 和 M c 为一类,前者的激发和发射波长均较后者要短一些,可以预期这两类抗菌紊的降解机理和降解产物结构是有差别的.T C,CT C 和 O T C 这类抗菌素碱性降解的作用机理普遍认为是由于 O H一的作用,蛛 上的轻墓形成氧负离子,向 CI ,发动分子内亲核进攻,经 电子转移,c 环断裂,生成具有内酷结构的异构体 ( 见图 2 ).9眠N ( C H3)2C H3O H OO H O豁倒踢一{书, , 皿} 全护全至CH3)2_犷i淤脚淤嚣眠图 2 T C,C T C 和 O T C 碱性降解机理如果 T C,C T C 和 O T C 的上述亲核断环机理成立,那么,反应产物与反应物相 比,只发 生了分子 内化学键的变化,各原子组成仍然不变.以 C T C 为 例,其 分 子 式 为q Z H 23 Os NZ CI,降解 后生成 的含 内酷产物 的分子式 仍为 q 践3q 从 a,分子量 47 8.86,计算各元素的百分组成为: C 5 5.18 %,H 4.8 4 %,N5.8 5 %,C l 7.4 0 %,0 2 6.7 3 %.对经过分离、提纯得到的 C T C 降解物的 固体作元素分析的结果为: c 54.84 %,H 4.90 %,N5.7 6 %,C l 7.4 3 %.质谱分析得到 的降解物分子量为 4 76,由此计算降解物分子 中各元素原子数为: C 2,H 23,N Z,C l l,0 8,分子式为 qZ H 23 O S N Z CI,与按前面机理降解所得产物的分子式相同.C T C 碱性降解物的红外分析结果,证明了含内醋结构降解物的形成.比较 C T C 及其降解物的红外光谱,其显著差异是降解物在 1 7 58C m一 `处有一个很强的拨基吸收峰.这是由于形成内酷后,酷内氧的吸电子作用,使拨基中碳原子上的电子云密度减小,碳氧双键的力常数增加,同时也 由于成环后张力变大,使拨基的红外吸收峰明显地向高波数方向移动,而且强度第 3期 赵一兵等:四环素类抗菌素碱性降解荧光增敏作用研究增大.综合上述的分析结果,可以确认,C T C 碱性降解物结构如机理中所示,即上述机理是正确的,对 T C 和 O T C 的研究得到同样的结论.从降解物的结构上看,原有的共扼体系 I 由于 C 环断裂,双键数目减少,形成新的共扼体系 1,因此可以预期其光吸收波长必然变小.同样,把共扼体系 1 看作。 , 日不饱和体系,将苯环作延伸双键处理,同时考虑成环的。取代,用经验规则对降解物共扼体系 1 的最大吸收波长进行计算,得:几anr二= 2 17 n m + 2 x 3 o n m (延伸双键 ) + l on m ( 。 取代烷基 ) + 12n m ( p取代烷基 ) +3 0 n m (日取代 O H ) 一 sn m (溶剂校正 ) = 3 2 1n m此计算值与实验中 T C,C T C 和 O T C 的碱性降解物荧光的激发波长接近,同时考虑共扼体系 1 在降解前后不发生变化,可以认为这 3 种抗菌素的碱性降解物的荧光是 由共扼体系 1吸光后发出的,其荧光增强效应显然是由于内酷的形成.这种内酷结构 的荧光增强现象尚属首例.一个不容忽视的因素是 内醋环上氧的未成键电子对共扼体系 扭的影响,其作用机理需进一步研究.由于 C T C 分子中 q 上的抓原子的空间排斥作用,使 q 上的经基更易发生分子内的亲核反应.因此,c T C 较 T C 和 O T C 容易发生降解反应.同时 由于 c T C 分子在苯环上的取代基c l 上的未成键电子的 P一二共扼作用,降解物的荧光激发波长明显 比 T c 和 O c T 降解物荧光激发波长红移.T C 和 O T C 虽然在 几 上相差一个轻基,但此经基对共扼体系 m 影响甚微,因此 T C 和 O T C 的降解物荧光激发波长差别很小.M C 和 D C 这类抗菌素由于在 q 上没有轻基,因此 C 环不发生断裂,即其降解机理与 T c等不同.但是,M c 和 cD 可以通过分子 内的互变异构作用在 B 环 的 1C2上形成酮拨基,而 C S上的轻基同样可以在 O H一的作用下,形成氧负离子,并向 1C2发动分子内亲核进攻,经 电子转移,B 环断裂,亦生成具有内醋结构的异构体如图 3.O H N ( C 3H )2凡? H 叮(C氏 )2胜 -ou -ol图 3 M C 和 以二的碱性降解机理产物中新形成的共扼体系 W与反应物的共扼体系 I 几乎一样,其最大 吸收波长不会发生明显变化.根据经验规则估算的最大吸光波长仍为 3 81n m,这与实验中 M C 和 D C 及其碱性降解物的荧光激发波长是一致的,这说明所推测的机理是可能的,而且降解物结构分析数据也说明生成了内醋结构化合物.相应的荧光增强效应显然也是由于内酷形成所造成的.比较 M C 和 D C 在 B 环上的亲核断环机理与 T C,C T C 和 O T C 在 C 环 上的断环机理,由中 国 科 学 ( B辑 ) 第 27 卷于前者包含有分子内的互变异构过程,因此 M C 和 D C 较 T C,C T C 和 O T C 难降解,反映为降解所需时间较长.同时如图 4 所示,由于 M c 和 D c 降解物分子内的 内酷结构不象 T c,c T c和 O T C 的降解物内酷结构那样紧靠苯环的大二键体系,内醋环上氧原子的孤对电子不能更有效地作用于苯环大二键体系,因此增敏作用相对较弱.:o协产岁图 4 T C.C T C 和 O T C 降解物 (a)和 M c,DC 降解物 ( b) 共扼体系的电子云图M c 和 cD 降解物结构上的差别在于它们在 c6 上的取代基不同,前者为亚 甲基 c HZ , 以双键与 蛛 相连 ;后者为甲基 c H。 , 以单键与吼 相连.因此,前者的共扼体系双键数 目较后者多一个,反映在荧光光谱上,前者的荧光激发和发射波长均较后者红移.利用 T Cs的碱性降解特性可以建立这些抗菌素的高灵敏度测定方法,结果如表 2 所示.表 2 T Cs的碱性降解测定降解时 间 / m in 线性范围 / m ol·L一 ’检测限 / m ol·L一` 较天然荧光增 强 (倍 )OCO八U尸Jùt一rJg,ù,二刁.孟M CU咬二8.o x l o一 9 一 1.0 只 10一54.0 x 10一 9 一 5.0 冰 10一 67.0 x 10一9一 5.0 x 10一 65.0 火 10一 8一 5.0 x 10一 58.0 x 10一 吕一 5.0 x l 0一 ,6.0 X 103.0 x 105 0 x 105.0 X 108.0 x 100叮ùnU1内乙1人八j3sC一℃rT毛一T朋丁由于 T Cs的理化性质非常相似,而且其产品往往含有其他抗菌素杂质,因此其混合物的分别测定一直是这类抗菌素生产和临床检测希望完善解决的问题.我们利用金霉素室温即降解而其它抗菌素室温不发生降解的特性,进行 了 C T C 与其他抗菌素两组分混合物的分别测定 ;同样,利用 T C,C T C,O T C 与 M C,D C 降解机理和产物的差异,研究了这两类抗菌素的两组分混合物的分别测定 ;还进行了一些三组分混合物的分别测定,表 3 列 出了尿液中的测定结果.实验还发现 L̀2〕 , 四 环素类抗菌素碱性降解物 与一些金 属离子,如 M扩十 ,c a “+ ,s产` ,B扩十 ,nzZ 十 , c 矛十等,形成强荧光的鳌合物,如 M扩十鳌合物荧光强度较相应降解物的荧光强度分别增强: T C : 4 0 %,C T C:5 %,O T C:3 0 %,M C: 4 0 0 %,D C:3 5 0 % ; 较 T Cs的天然荧光分别增强:T C:81 倍,C T C:19 9 倍,O T C : 26 倍,M C:60 倍,D C:17 倍 ; 而且重要 的是形成鳌合物后荧光激发和发射的峰位置较降解物本身的峰位置不发生改变,这显然是金属离子微扰的配位体发光,其发光方式表示为:M 一 L + h ,e x~ M 一 L甘M 一 L价~ M一 L + h , ~第 3期 赵一兵等:四环素类抗菌家碱性降解荧光增敏作用研究 28 1表 3尿液中 T Cs混合物的回收测定加入 t / o m卜 L一 ’测得 t / o m卜 L一 ` 回收率/ %0n UO八ù 1ón Cǎ UXX盆火飞ú8内J` .114.二nù 4尸、̀曰ó Un yU10月,70口Dnù80才nUR一,几SQ夕9洲内̀OJo了,二飞ù ,比J4J.i月呼401̀几,内且,月吟几人nlnǎU00noùoO火XX又0,二4`.二弓ù几̀J月J气一侣且哎曰̀é,1舟,足工、,盗哦CT眠cD优cM票T峨黑这一结果显示,T C s 降解物与金属离子形成鳌合物的荧光由降解物配体的共扼体系 m( T C,C T C 和 O T C 降解物 )和 lV ( D C 和 M C 降解物 )吸光后发射,据此认为金属离子同相应共扼体系 1 和 VI 上相关的配位原子整合,而不是与共扼体系 n 上的配位原子鳌合.由此,可对荧光鳌合物的整合方式进行合理的表示 (图5 和图 6,M 为金属离子 ).+十R: C H J 凡 N ( CH, ) 2O H以〕N氏L||||匕班图 5 T C,C T C,O T C 降解物与金属离子的整合方式10 39 710 39 59 810 49 610 39 79 59 79 79 810 010 210 69 79 810 39 9N ( C氏 )2 一 r 一 一 〕N ( C氏 )2厂|ó比、|匕O HC O N姚O H(力N氏厂|ó“火|L图 6 M C,I X : 降解物与金属离子的彼合方式类似地,可正确表示 T C。与 Eu 3 十反应生成的强荧光整合物的整合方式.今 考 文 献1 0l 1l 2cS h o n e i e h C.H u h mer A F R,R a b e l 5 R.e t al.eS p a r a t io n a n d an al y s i s o f 沐 P t id e s an d pm t e ins.人n d y t i e日 C h恻s t口,19 5,6 7 ( 12 ):R 15 5一 R 18 1H o ff m an A 5.In t e llig e n t pol y me r s i n m ed i e in e an d b io t e e h no log y.M ac m mo lecu lar S y m户洲 l a.1 9 9 5.9 8 : 6 4 5一 6 6 4段。 p e r 5 A.M e g ownL B,W arne r 1 M.M o lce u lar fl our e cs en e e,P h oa p hor二e n e e an d e he m Uum inesce nce: P ec t o me t即.六刀 .-ly t ie al C h e m i st 口,19 9 4.66 ( 1 2 ):R 4 2 8 ~ 4 4 4V an de nesR J,V e lt ho sr t N H.B r in k m an U A T. e r a l.aL ser·in d u e e d fl uo r esc ene e d e ect t iono f na t i v e一n uoresce n t a n al y t e sin C o lu mn liq u id 。 h or nar t叩r a p h y. a e ir t icale v a lua t ion.J o u nr a l o f C h omra t o g ar P h y A.1 9 9 5.7 0 4 ( 1 ) : 1一 2 5Y e u吧 E 5.C h e m i e al a nal ys i s o f 5 1呀 le h u 「n a n e yt t h ocr yt es.cA co unt s o f C h e m i以 Re se 砚h,19 9 4.2 7 ( 12 ) : 4 0 9一 4 14L i s 5.n̂a ly t i e al a p p li e a t i o n : o f lan t h a n id e lu而in es e e n e e in os lu t io n.C h e m i a 八门 a li t y e翻 a,1 9 9 3,3 8 ( 4 ) : 4 4 3 一 4 5 4X u Y Y,H em m ila 1 A.OLv g r e n T N E.C冶.fl ourcese cn e e f fe e t in t im e一roes lv de n ou m im mu n o 创架田 y-sA r e v i e w.八刀目y s t.19 9 2, 1 1 7 ( 7 ) : 1 0 6 0一0 6 9P e r ez ho w ar d G M.We i l P A.段忱 he m J M.Y e as t T A T A b in d i飞 P or te in in t e r a e t ion w i t h D N A:n uo ~e nc e d e t e mr in a t io no f o il gome ir e 吕at t e.灼u i il bir u m b in di吃, o n一r a t e , a n d d iocsi a t i o n k i n e t i e s.iB oc h e而: t ty,1 99 5.3 4 ( 2 5 ):8 0 0 5一 8 0 1 7L习50 J N.K u m m e r A.L i e han E. e t al.eDv e ol pm e n t o f a p a rt i e l e co n e e n t r a t io n o f l茄 in场v in e m i lk.J ou m目o f gA ire u lt u-arl an d Fcx 记 C hem is t斗.1 9 9 3,4 1 ( 4 ) : 68 2 一 68 6郭祥群.许金钩,陈国珍.光化学荧光分析法.分析化学,1 9 91,19:24 一 2 52陈国珍,黄贤智.刘文远,等.紫外一可见分光光度法.北京:原子能出版社,1 9 8 3赵一兵,常文保,慈云祥.四环家类抗菌素碱性降解物与碱土 金属整合物的荧光研究.高等学校化学学报,19 92,13 :1 3 7 8一 1 3 7 9,̀斑嘴ùó、ù6

四环素类抗菌素碱性降解荧光增敏作用研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/107351/%e5%9b%9b%e7%8e%af%e7%b4%a0%e7%b1%bb%e6%8a%97%e8%8f%8c%e7%b4%a0%e7%a2%b1%e6%80%a7%e9%99%8d%e8%a7%a3%e8%8d%a7%e5%85%89%e5%a2%9e%e6%95%8f%e4%bd%9c%e7%94%a8%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

四环素类抗菌素碱性降解荧光增敏作用研究

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