PS/γ-分泌酶负责老年痴呆症相关蛋白β淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、信号转导受体Notch和其他I型跨膜蛋白的剪切，其组成单位至少有四种：presenilins（PS,包括PS1和PS2）、nicastrin（NCT）、APH-1和PEN-2。尽管人们对这四种组分在蛋白质水平上的有机的相互调解作用已经有所了解，但是，关于它们的转录调控却只知之甚少。在这项研究中，我们克隆了PEN-2和APH-1A两种基因启动子区，并通过荧光素酶活性分析鉴定了这两种基因启动活性必需的最小启动子区。序列分析表明，在这些区域存在许多潜在的转录因子的结合位点。点突变和胶迁移实验揭示AP4和HIF-1结合到APH-1A...The intramembrane proteolytic cleavages of Alzheimer’s b-amyloid precursor protein (APP) and signaling receptor Notch are mediated by the PS/g-secretase complex, which comprises of presenilins (PS, including PS1 and PS2), nicastrin (NCT), APH-1 and PEN-2. Although the four components have been shown to coordinately regulate each other at the protein level, information regarding their transcription...学位：理学博士院系专业：生命科学学院生物医学科学系_细胞生物学学号：B20042602

王瑞山

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 学校编码：10384                                                                            类号       密级       学号：    B200426020                                                                      UDC                   博士学位论文   γ-分泌酶组分基因 APH-1A 和 PEN-2 的转录调控  Transcriptional Regulation of APH-1A and PEN-2, Two Key Components of γ-secretase Complex   王   瑞   山                   指导教师姓名: 许华曦 教授、博导 申请学位级别:    博    士 学科专业名称: 细 胞 生 物 学 论文提交日期: 2007  年  4  月 论文答辩日期: 2007  年  4  月 学位授予日期:   答辩委员会主席:陶涛 教授、博导 评阅人:        2007  年  4  月厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学学位论文 创性声明原   兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。                            声明人（签名）： 2007 年   月    日 厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学学位论文著作权使用声明  本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1.保密（），在年解密后适用本授权书。 2.不保密（  ） （请在以上相应括号内打“√”）    作者签名：          日期：      年      月      日 导师签名：          日期：      年      月      日 厦门大学博硕士论文摘要库摘 要  I 摘      要  PS/γ-分泌酶负责老年痴呆症相关蛋白 β 淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、信号转导受体 Notch 和其他 I 型跨膜蛋白的剪切， 其组成单位至少有四种：presenilins（PS, 包括 PS1 和 PS2）、nicastrin（NCT）、APH-1 和 PEN-2。尽管人们对这四种组分在蛋白质水平上的有机的相互调解作用已经有所了解，但是， 关于它们的转录调控却只知之甚少。在这项研究中，我们克隆了 PEN-2 和APH-1A 两种基因启动子区，并通过荧光素酶活性分析鉴定了这两种基因启动活性必需的 小启动子区。序列分析表明，在这些区域存在许多潜在的转录因子的结合位点。点突变和胶迁移实验揭示 AP4 和 HIF-1 结合到 APH-1A 启动子上，而 CREB 结合到 PEN-2 启动子上。进一步的研究表明，由 forskolin 激活的CREB 显著地促进 PEN-2 mRNA 和蛋白质的表达，而对 γ-分泌酶的其他组分没有影响。通过 NiCl2 处理（一种模拟缺氧的化学条件）激活 HIF-1， APH-1A mRNA 和蛋白质的水平显著增加，而 PEN-2 和 PS1 的蛋白水平只是在长时间的NiCl2 处理条件下才会增加。更为重要的是，APP 蛋白酶解的各种代谢产物的水平在 forskolin 或者 NiCl2 处理的条件下也发生了改变。总之，我们的结果表明，APH-1A 和 PEN-2 的转录分别受 HIF-1 和 CREB 的特异性调控，并且这种调控的特异性可能赋予 APH-1 和 PEN-2 其他特有的生理功能。 关键词:  γ-分泌酶；APH-1A；PEN-2；转录调控；HIF-1； CREB           厦门大学博硕士论文摘要库Transcriptional Regulation of APH-1A and PEN-2, Two Key Components of γ-secretase Complex  II ABSTRACT   The intramembrane proteolytic cleavages of Alzheimer’s β-amyloid precursor protein (APP) and signaling receptor Notch are mediated by the PS/γ-secretase complex, which comprises of presenilins (PS, including PS1 and PS2), nicastrin (NCT), APH-1 and PEN-2. Although the four components have been shown to coordinately regulate each other at the protein level, information regarding their transcriptional regulation is scarce. In the present study, we characterized upstream regions of the human PEN-2 and APH-1A genes and identified sequences critical for their promoter activity. Sequence analysis of these regions revealed several potential transcription factor binding sites. Site mutations and gel shift assays showed that CREB binds to PEN-2 promoter, whereas AP4 and HIF-1 bind to APH-1A promoter. Furthermore, activation of CREB by forskolin treatment dramatically promoted the expression of PEN-2 mRNA and protein, but not the expression of the other three γ-secretase components. Activation of HIF-1 by nickel (chemical hypoxia) significantly promoted the expression of APH-1A mRNA and protein; whereas increased protein levels of PEN-2 and PS1 were only observed after chronic nickel treatment. Importantly, the levels of various proteolytic metabolites of APP were also altered by forskolin or nickel treatment. Together, our results demonstrate the differential transcriptional regulation of PEN-2 and APH-1A expression, and suggest additional physiological functions uniquely assigned to PEN-2 and APH-1A.    Key words: γ-secretase, APH-1A, PEN-2, transcriptional regulation, HIF-1, CREB  厦门大学博硕士论文摘要库目 录  III  目    录  前言…………………………………………………………………………………1 1.老年痴呆症…………………………………………………………………1 2.Aβ 假说……………………………………………………………………1 3.三种分泌酶…………………………………………………………………5 4. γ-分泌酶组分基因表达的调控…………………………………………10 5. 主要内容和目的……………………………………………………………13 材料与方法………………………………………………………………………13 1. 生物信息学分析………………………………………………………13 2. 肝脏组织总 RNA 的提取………………………………………………13 3. 5´-RACE……………………………………………………………13 4. 细胞培养………………………………………………………………15 5. APH-1A 和 PEN-2 启动子的克隆及荧光素酶报告基因载体的构建…16           6. 瞬时转染和荧光素酶的活性分析……………………………………16 7. NiCl2 和 forskol in 处理…………………………………………19 8.细胞核抽提物的制备………………………………………………19 9. 胶迁移分析……………………………………………………………20 10. CHIP 分析……………………………………………………………21 11. Northern blot………………………………………………………22 12. Western blot 和抗体………………………………………………22 13. Aβ 的检测……………………………………………………………23 14. Pulse-chase 分析……………………………………………………23 结果…………………………………………………………………………………24 1. APH-1A 和 PEN-2 基因转录起始位点的定位…………………………24 2. APH-1A 和 PEN-2 基因启动子的克隆与功能性分析…………………25 2.1 启动子预测分析…………………………………………………25 2.2 APH-1A 基因启动子的克隆与功能性分析………………………25 厦门大学博硕士论文摘要库γ-分泌酶组分基因 APH-1A 和 PEN-2 的转录调控  IV2.3 PEN-2 基因启动子的克隆与功能性分析.………………………30   3. APH-1A 启动子含有转录因子 AP4 和 HIF-1 的结合位点……………33 4. HIF-1 调控 APH-1A 基因的表达，缺氧处理增加 γ-分泌酶介导的  Aβ     和 NICD 的形成……………………………………………………………40 5. PEN-2 启动子含有转录因子 CREB 的结合位点…………………………43 6. CREB 上调 PEN-2 的表达…………………………………………………49 讨论…………………………………………………………………………………52 参考文献…………………………………………………………………………55                      厦门大学博硕士论文摘要库CONTENTS  V CONTENTS  INTRODUCTION………………………………………………………………1 1. Alzheimer’s disease……………………………………………………1 2. Aβ hypothesis……………………………………………………………1 3. Three kinds of secretases……………………………………………5 4. Transcriptional regulation of γ-secretase components…………………10 5. The aim and contents……………………………………………………13 MATERIALS AND METHODS …………………………………………13 1. Bioinformatic analysis………………………………………………………13 2. Extraction of total liver RNA………………………………………………13 3. 5´-RACE……………………………………………………………………13 4. Cell culture…………………………………………………………………15 5. Cloning of APH-1A and PEN-2 promoter, and construction of luciferase    report constructs……………………………………………………………16 6. Transant transfection and luciferase activity assay………………………16 7. Treatment with NiCl2 and forskolin………………………………………19 8. Preparation of nuclear extract……………………………………………19 9. Gel shift assay………………………………………………………………20 10. CHIP assay…………………………………………………………………21 11. Northern blot………………………………………………………………22 12. Western blot and antibodies………………………………………………22 13. Aβ assay……………………………………………………………………23 14. Pulse-chase assay…………………………………………………………23 RESULTS…………………………………………………………………24 1. Identification of the transcription start site of APH-1A and PEN-2……24 2. Cloning of APH-1A and PEN-2 promoter, and functional assay………25 a. Prediction of promoter…………………………………………………25 厦门大学博硕士论文摘要库Transcriptional Regulation of APH-1A and PEN-2, Two Kay Componets of γ-secretase Complex  VIb. Cloning of APH-1A promoter, and functional assay……………………25 c. Cloning of PEN-2 promoter, and functional assay……………………30 3. APH-1A promoter contains AP4 and HIF-1 binding sites………………33 4. HIF-1 regulates the expression of APH-1A, and hypoxia treatment increases the formation of γ-secretase-mediated Aβ and NICD…………40 5. PEN-2 promoter contains CREB binding site……………………………43 6. CREB upregulates the expression of PEN-2………………………………49 DISCUSSION……………………………………………………………………52 REFERENCE……………………………………………………………………55     厦门大学博硕士论文摘要库图目录  VII 图 目 录  图的序号                                                         页数                1.1  APP 代谢途径…………………………………………………………………3 1.2  γ-分泌酶组分的示意图………………………………………………………8 2.1  5´-RACE 反应原理.…………………………………………………………14 2.2   APH-1A 和 PEN-2 基因 5′侧翼序列的生物信息学分析(I)……………25 2.3   5′-RACE 定位 APH-1A 和 PEN-2 基因的转录起始位点…………………26 2.4   APH-1A 和 PEN-2 基因 5′侧翼序列的生物信息学分析(II)……………27 2.5   APH-1A 启动子荧光素酶报告基因载体的构建……………………………28 2.6   APH-1A 基因启动子的荧光素酶活性功能性分析…………………………29 2.7   PEN-2 启动子荧光素酶报告基因载体的构建……………………………31 2.8   PEN-2 基因启动子的荧光素酶活性功能性分析…………………………32 2.9   人类 APH-1A 基因启动子的特征……………………………………………34 2.10  APH-1A 启动子实突变体的测序结果………………………………………35 2.11  人 APH-1A 基因启动子突变体的荧光素酶活性分析………………………36 2.12  APH-1A 基因启动子与 HIF-1 结合的胶迁移分析…………………………38 2.13  APH-1A 基因启动子与 AP4 结合的胶迁移分析……………………………39 2.14  Northern blot 分析在 HIF-1 激活条件下 APH-1A 基因 RNA 水平的变化…41 2.15  HIF-1 对 γ-分泌酶组分的表达以及对 APP 和 Notch 剪切的作用…………42 2.16  PEN-2 基因启动子的特征…………………………………………………44 2.17  PEN-2 基因启动子突变体的测序结果……………………………………45 2.18  人 PEN-2 基因启动子突变体的荧光素酶活性分析………………………46 2.19  PEN-2 基因启动子的胶迁移分析…………………………………………47 2.20  CHIP 分析 CREB 结合到 PEN-2 启动子上…………………………………48 2.21  Forskolin 激活 CREB，进而刺激 PEN-2 基因的转录和蛋白表达………50 2.22 Forskolin 增加 PEN-2 蛋白的表达和 sAPPα与 Aβ的分泌，但是并不影响 γ-分泌酶的其他组分的蛋白水平表达和 Notch 剪切…………………51  厦门大学博硕士论文摘要库γ-分泌酶组分基因 APH-1A 和 PEN-2 的转录调控  VIII表 目 录  表的序号                    页数 2.1 APH-1A 和 PEN-2 基因 5′侧翼区序列的生物信息分析……………………15 2.2 APH-1A 启动子报告基因载体的构建过程中使用的引物……………………17 2.3 PEN-2 启动子报告基因载体的构建过程中使用的引物……………………17 2.4 构建 APH-1A 基因突变体所用的引物…………………………………………18 2.5 构建 PEN-2 基因突变体所用的引物…………………………………………19 2.6 用于 GSA 的寡聚核苷酸………………………………………………………21                   厦门大学博硕士论文摘要库英文缩略词  IX 英文缩略词  英文缩写 英文全名 中文名称 AD Alzheimer’s disease 老年痴呆症；阿尔茨海默症 AICD APP intracellular domain  AP1 activator protein 1  AP4 activator protein 4  APH-1 anterior pharynx-defedtive 1  APP beta-amyloid precursor protein β-淀粉蛋白前体蛋白 ATF6 Activating transcription factor 6  Aβ beta-amyloid β-淀粉样蛋白 Asp2 aspartyl protease 2  BACE beta-site APP cleaving enzyme  CTF C-terminal fragments  cDNA complementary DNA 互补脱氧核糖核酸 CREB cAMP-responsive element binding protein  DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Dulbecco’s 的改良 Eagle’s 培养基 gDNA genome DNA 基因组脱氧核糖核酸 EDTA Ethylenediamineteraacetic acid 乙二胺四乙酸 ER Endoplasmic Reticulum 内质网 GSA gel Shift Assays 胶迁移分析 HIF-1 hypoxia inducible factor-1  memapsin2  membrane anchored protease of the pepsin family  mRNA Messenger RNA 信使 RNA NCT nicastrin  NFAT nuclear factor of activated T-cells  NFT neurofibrillar tangles 神经元纤维缠结 NICD Notch intracellular domain  NTF N-terminal fragments  PBS Phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PEN-2 presenilin enhancer 2  PHF paired-helical filament  RACE Rapid Amplification of cDNA Ends  rRNA Ribosome RNA 核糖体 RNA siRNA Small interference RNA  UTR untranslation region 非翻译区 TACE tumor necrosis factor-α converting enzyme  TGN trans Golgi network 高尔基体反面的网状结构 wt Wide type 野生型 厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库前 言  1 前      言   1、老年痴呆症(Alzheimer’s disease, AD)  AD 是一种与年龄相关的、进行性的、神经退行性的痴呆性疾病[1]。AD 患者表现为记忆力的逐渐衰退，认知能力、推理判断能力的下降，这些功能的紊乱表现出不可逆转性。AD 患者多发生在 65 岁以上的人群中，据统计在该年龄阶段的人体中有约 10%的人，85 岁以上的人群中有约 50%的人患有此病；不过也有一些阿尔茨海默病，65 岁以前发病，所以又称早发性老年痴呆症，发病率不高（<2%）。尽管大多数的 AD 病例是“散发性的”，也就是说，AD 的发生没有明显地遗传特征，但是，也存在具有明显遗传特征的 “家族性的 ”AD（Familial form of AD，FAD），常常表现为早发性老年痴呆症。虽然 FAD 病例比较少见，但是它们为探讨 AD 的病理学机制提供了宝贵的材料。 1907 年，Dr. Alzheimer 即报道了一位 51 岁女性痴呆患者表现出神经元的丢失、神经元细胞内神经元纤维缠结(neurofibrillar tangles, NFT)和细胞外淀粉样斑（amyloid plaques）。后来，神经元纤维缠结和淀粉样斑成为诊断阿尔茨海默病的两个重要的神经病理学特征[2-4]。NFT 是细胞内蛋白质的病理性聚积形成的，可见于神经元细胞体。NFT 基本的单位是配对螺旋纤维（paired-helical filament，PHF），由高度磷酸化的微管相关蛋白 tau 组成[2, 5]。Tau 的高度磷酸化作用使 tau 从微管上解离，造成非结合态的 tau 增加，并引发 PHF 和 NFT 的形成。淀粉样斑是细胞外多种蛋白质的非溶性集结物，主要成分是 beta-amyloid（Aβ）[1-4, 6]。 2、Aβ假说 AD 的发病机制至今仍不清楚。有许多假说对其机制进行阐述，其中有两种假说为多数学术界人士认可： neuronal cytoskeletal degeneration hypothesis 和amyloid cascade hypothesis[1, 3-5]。前者认为高度磷酸化的 tau 蛋白引起微管蛋白厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. 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Transcriptional Regulation of APH-1A and PEN-2, Two Key Components of γ-secretase Complex

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