背景：慢性粒细胞白血病(ChronicMyelocyticLeukemia，CML)是一种致命性的恶性造血干细胞疾病，发生源于人9号和22号染色体的易位，导致费城染色体t(9;22)(q34;q11)和融合蛋白P210BCR/ABL的形成。P210BCR/ABL显示异常增强的酪氨酸激酶活性，过度激活下游Ras、PI3K/Akt等信号通路导致肿瘤的发生。FoxO蛋白家族作为转录因子通过调节细胞内多种重要基因的表达，而介导细胞周期、DNA损伤修复、凋亡、氧化应激、细胞分化代谢等细胞生理过程，与肿瘤的发生关系密切。hSHIP(HumanSH2-containinginositol-5-phospha...Background：Chronic myelocytic leukemia (CML) is a lethal hematopoietic stem cell malignancy characterized by the t(9,22) chromosomal translocation,a translocation between the long arms of chromosomes 9 and 22, resulting in the formation of the Philadelphia (ph) chromosome and BCR/ABL fusion protein. BCR/ABL exhibiting constitutively active tyrosine kinase activity interacts with a number of signal...学位：医学硕士院系专业：医学院临床医学系_内科学学号：2452008115342

杜艳

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  学校编码：10384                              分类号      密级             学号：24520081153425                                     UDC                  硕  士  学  位  论  文  转录因子 FoxO3a 异常在慢性粒细胞性白血病细胞中作用机制的研究 Study on the abnormal expression of the transcription factor FoxO3a and its mechanism in chronic myelocytic leukemia    杜 艳 指导教师姓名： 王玮 副教授 专 业 名 称 ： 内科学 论文提交日期： 2011 年  月 论文答辩日期： 2011 年  月 学位授予日期： 2011 年  月  答辩委员会主席：             评    阅    人：              2011 年 5 月   转录因子FoxO3a异常在慢性粒细胞性白血病细胞中作用机制的研究    杜 艳       指导教师   王玮 副教授              厦门大学 厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活动规范（试行）》。 另外，该学位论文为（厦门大学附属东南医院王玮副教授）课题（组）的研究成果，获得（漳州市科技计划项目及福建省青年人才基金）课题（组）经费或实验室的资助，在（厦门大学抗癌研究中心）实验室完成。（请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。）  声明人（签名）：             年   月   日厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库   厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： （     ）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于   年  月  日解密，解密后适用上述授权。 （     ）2.不保密，适用上述授权。 （请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。）  声明人（签名）：             年   月   日厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库   厦门大学博硕士论文摘要库摘要  摘 要 背景：慢性粒细胞白血病(Chronic Myelocytic Leukemia，CML)是一种致命性的恶性造血干细胞疾病，发生源于人 9 号和 22 号染色体的易位，导致费城染色体 t(9;22)(q34;q11)和融合蛋白 P210BCR/ABL 的形成。P210BCR/ABL显示异常增强的酪氨酸激酶活性，过度激活下游 Ras、PI3K/Akt 等信号通路导致肿瘤的发生。FoxO 蛋白家族作为转录因子通过调节细胞内多种重要基因的表达，而介导细胞周期、DNA 损伤修复、凋亡、氧化应激、细胞分化代谢等细胞生理过程，与肿瘤的发生关系密切。hSHIP(Human SH2-containing inositol-5-phosphatase) 属于肌醇磷酸酯酶家族，含 SH2 结构域肌醇磷酸酯酶能通过负调控 PI3K/Akt 信号通路对造血细胞增殖、存活及终末细胞活化起作用。本文主要通过血清剥夺实验及转染 hSHIP 基因入 K562 细胞，以探讨 hSHIP 基因、PI3K/Akt 信号通路对FoxO3a 表达含量调节和细胞定位的改变及可能的机制；并构建特异性干扰FoxO3a 的 shRNA 真核表达载体转染 K562，探究干扰 FoxO3a 的表达对 K562细胞生存及凋亡的影响。 方法：免疫组化法检测 FoxO3a 的细胞定位改变；转化提取含 hSHIP 基因的 pcDNA3.1-GFP-hSHIP 真核表达载体，用脂质体法转染 K562 细胞。采用荧光显微镜观察转染效果，半定量 RT-PCR 法及 western blotting 检测 FoxO3a、Akt的 mRNA 及蛋白表达含量及磷酸化变化；合成特异性干扰 FoxO3a 的 shRNA，将其插入 pRNA-U6.1/Neo 载体，构建 pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a 干扰质粒，用脂质体法转染 K562 细胞，western blotting 检测干扰效率。Hoechst33258/PI 双染色法分析细胞凋亡；MTT 法检测细胞生长影响。 结果：免疫组化实验证明，血清激活 PI3K/Akt 信号通路可导致 FoxO3a 蛋白由胞核重定位于胞浆；转染了 hSHIP 基因的 K562 细胞株(K562/hSHIP-GFP)与对照组(K562/ GFP)相比，Akt mRNA、总 Akt 蛋白及 Akt 磷酸化水平明显下调，FoxO3a 蛋白的 mRNA 及蛋白含量明显增高；成功构建 pRNA-U6.1/Neo -FoxO3a 干扰质粒并转染 K562 细胞，结果显示 FoxO3a mRNA 及蛋白的表达含Ⅰ厦门大学博硕士论文摘要库摘要  量明显减少。与对照组相比，Hoechst33258/PI 检测显示干扰组细胞凋亡明显减少；MTT 法显示 K562 细胞生长显著增加。 结论：转染 hSHIP 基因能明显增加 FoxO3a 的表达量，减少 Akt 的表达及降低其磷酸化。hSHIP 基因能提高 FoxO3a 的表达机制可能是负调控 PI3K/Akt信号通路；构建的 pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a 质粒能明显减少 K562 细胞内的FoxO3a 蛋白表达，干扰效果确切。干扰 FoxO3a 表达促使 K562 细胞的增殖存活并抑制细胞凋亡。提示 FoxO3a 有抑制 K562 细胞的增殖，同时促进凋亡的作用。 关键词：FoxO3a；hSHIP；K562 细胞；RNA 干扰；Ⅱ厦门大学博硕士论文摘要库ABSTRACT  ABSTRACT Background：Chronic myelocytic leukemia (CML) is a lethal hematopoietic stem cell malignancy characterized by the t(9,22) chromosomal translocation,a translocation between the long arms of chromosomes 9 and 22, resulting in the formation of the Philadelphia (ph) chromosome and BCR/ABL fusion protein. BCR/ABL exhibiting constitutively active tyrosine kinase activity interacts with a number of signaling molecules leading to the activation of downstream signaling pathways such as Ras, PI3K/Akt, which are required for the pathogenesis. Forkhead box O (FoxO) transcription factors are emerging as an important family of regulatory proteins that modulate the expression of important genes involved in cell cycle control, DNA damagerepair, apoptosis, oxidative stress, cell differentiation, glucose metabolism and other cellular functions. hSHIP(Human SH2-containing inositol-5-phosphatase) is a member of phosphoesterase family, the SH2 domain downregulates proliferation, survival and differentiation of the hematopoietic cells through the PI3K/Akt signal.  To study the mechanism PI3K/Akt signal pathway and hSHIP regulating the expression of FoxO3a, We detected the relocalization and the expression of FoxO3a in the K562 cells respectively by Serum deprivation and transfecting hSHIP gene. Further, we constructed a shRNA specific for FoxO3a to test its function on proliferation and apoptosis of K562 cells. Methods：ObServe the relocalization of FoxO3a by immunohistochemistry in K562 cells. Transformate and extract pcDNA3.1-GFP-hSHIP plasmid, and then transfect into K562 cells by liposome. The expression of GFP were identified by Flurescent microscope to observe the efficiency of transfection. Semi-quantitative RT-PCR was employed to test the expression of FoxO3a mRNA, the protein level is identified by western blotting analysis. Synthesis and transfect siRNA specific for FoxO3a into K562 cells and then use semi-quantitative RT-PCR and western blotting Ⅲ厦门大学博硕士论文摘要库ABSTRACT  to test the expression of FoxO3a at both gene and protein levels. Apoptosis was detected by Hoechst 33258/Pl. Cell survival was determined by MTT assay. Result：Immunohistochemistry testified that the activation of PI3K/Akt signal pathway by serum resulted in the relocalization of FoxO3a protein from nuclear into cytoplasm.Contrasted to the control group (K562/ GFP), the levels of FoxO3a protein and mRNA expression were significantly increased in the transfection group (K562/hSHIP-GFP). Inversely,the expression of Akt were down- regulated. The RNAi plasmid pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a was constructed successfully. The results showed that FoxO3a-induced apoptosis was reduced reflected by Hoechst 33258/PI, while cell surviaval was incresed tested by MTT assay. Conclusion：hSHIP can signifieantly increase the expression level of FoxO3a and the possible mechanism is related to downregulation of the expression and phosphorylation of PI3K/Akt. Scilencing FoxO3a by using shRNA can remarkably reduce the expression of FoxO3a,and results in the survival of K562 cells and reduction of apoptosis,indicate that FoxO3a can signifiecantly inhibit survival and promote apoptosis of K562 cells. Key words: FoxO3a; hSHIP; K562 cells; RNAiⅣ厦门大学博硕士论文摘要库目录  目 录 摘 要.........................................................................................................Ⅰ ABSTRACT............................................................................................. Ⅲ 缩略词表................................................................................................. XIII  前 言...........................................................................................................1 一  FOXOS 结构 .......................................................................................................................2 1  FoxOs 的结构特点 ...........................................................................................2 2  FoxO3a 的结构与功能.....................................................................................3 2.1  DNA 结合区结构域：(DNA-binding domain,DBD) ............................. 3 2.2  核定位信号及核输出信号：(nuclear localization signal,NLS;nuclear export-signal,NES) ........................................................................................ 4 2.3  反式激活结构域：(transactivation domain,TAD） ................................ 5 3  分布...................................................................................................................6 二  FoxO3a 活性的调节....................................................................................................6 1  FoxO3a 的磷酸化调节.....................................................................................6 1.1  PI3K/Akt 信号通路调控途径 ................................................................6 1.2  PI3K 依赖 FoxO3a 通路调控途径 ........................................................8 1.3  非 PI3K 依赖通路调控途径 ..................................................................8 1.4  FoxO3a 的去磷酸化调节.......................................................................8 2  FoxO3a 乙酰化修饰调节.................................................................................9 3  FoxO3a 泛素化调节及降解.............................................................................9 三  FoxO3a 对细胞生物活性的调节........................................................................9 1  FoxO3a 对参与细胞周期调节.........................................................................9 2  FoxO3a 对细胞繁殖、凋亡、分化的影响...................................................10 3  参与分化组织中的代谢调节.........................................................................10 4  参与抗生物老化和氧化应激抵抗................................................................. 11 5  参与免疫调节................................................................................................. 11 6  FoxO3a 的抑癌作用及其异常与肿瘤发展的关系....................................... 11 7  FoxO3a 与慢性粒细胞白血病.......................................................................12 四  本研究的目的及内容................................................................................................13 Ⅴ厦门大学博硕士论文摘要库目录  第一章 hSHIP 在 K562 细胞对 FOXO3a 表达的影响及机制探讨 ...15 一 材料与方法........................................................................................................15 1  实验材料.........................................................................................................15 1.1  菌株及质粒 ..........................................................................................15 1.2  主要试剂及耗材 ..................................................................................15 1.3  主要仪器及设备 ..................................................................................17 1.4  主要溶液的配制 ..................................................................................18 2  试验方法.........................................................................................................21 2.1  免疫组化 SP 法 ....................................................................................21 2.2  转化 ......................................................................................................22 2.3  质粒抽提 ..............................................................................................23 2.4  hSHIP 基因及空载转染 K562 细胞： ................................................24 2.5  hSHIP 对 K562 细胞 FoxO3a、Akt 表达量及磷酸化水平的影响 ...24 二 结果与分析 ....................................................................................................................... 28 1  免疫组化法检测 FoxO3a 在 K562 细胞内定位...........................................28 2  hSHIP 对 K562 细胞 FoxO3a、Akt 表达量及磷酸化水平的影响 .............29 2.1  荧光检测 hSHIP 基因及空载转染......................................................29 2.2  半定量 RT-PCR 检测 FoxO3a、Akt mRNA 表达水平......................29 2.3  western blotting 检测 FoxO3a、总 Akt 蛋白表达及磷酸化水平......30 三 讨论.........................................................................................................................................31 第二章 干扰 FOXO3a 基因对 K562 细胞增殖、凋亡的影响 .................33 一 材料与方法 ........................................................................................................................33 1  实验材料.........................................................................................................33 1.1  质粒、引物、菌株和细胞 ..................................................................33 1.2  主要试剂及仪器见第一章 1.2 和 1.3 .................................................33 1.3  主要溶液的配制 ..................................................................................33 2  实验方法.........................................................................................................33 2.1  质粒 pRNA-U6.1/Neo 酶切及回收 .....................................................33 2.2  质粒酶切产物的纯化回收 ..................................................................34 2.3  RNA 干扰片段的设计与合成 .............................................................34 2.4  互补片段退火 ......................................................................................36 2.5  目的基因与载体的连接 ......................................................................36 2.6  重组质粒的转化、鉴定及测序 ..........................................................37 2.7  RNA 干扰 FoxO3a 对 K562 细胞生存、凋亡的影响 .......................38 二 结果与分析 ........................................................................................................................39 1  pRNA-U6.1/Neo 质粒酶切、互补片段退火及鉴定 ....................................39 Ⅵ厦门大学博硕士论文摘要库目录  1.1  pRNA-U6.1/Neo 质粒酶切回收 ..........................................................39 1.2  互补片段退火 ......................................................................................40 1.3  pRNA-U6.1/Neo 重组质粒阳性克隆鉴定 ..........................................40 1.4  western-blotting 检测 pRNA-U6.1/Neo-FoxO3a 质粒干扰效率 ........ 40 2  MTT 法检测 RNA 干扰 FoxO3a 对 K562 细胞存活的影响 .......................41 3  Hoechst33258/PI 染色法检测 RNA 干扰 FoxO3a 对 K562 细胞凋亡的影响...............................................................................................................................42 三 讨论.........................................................................................................................................42 1  FoxO3a 干扰质粒的构建...............................................................................42 2  RNA 干扰 FoxO3a 对 K562 细胞生长和增殖的影响 .................................44 3  RNA 干扰 FoxO3a 对 K562 细胞凋亡的影响 .............................................44 总 结......................................................................................................... 47 参考文献................................................................................................... 49 致谢........................................................................................................... 61 Ⅶ厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. 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Study on the abnormal expression of the transcription factor FoxO3a and its mechanism in chronic myelocytic leukemia

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