摘要 研究背景 动脉粥样硬化是一种动脉壁慢性炎症性疾病，其中含有apo-B脂蛋白颗粒在动脉壁的潴留和修饰是动脉粥样硬化发病机制特征之一，而分泌型磷脂酶A2-IIA（secretoryphospholipaseA2ofgroupIIA，sPLA2-IIA）可水解磷酸卵磷脂的2位酯键，sPLA2-IIA修饰的LDL与蛋白聚糖的亲和力增加，促进脂蛋白潴留，其水解后生成的游离脂肪酸和溶血磷脂，可产生重要的信号分子或进一步成为炎性介质，从而改变内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞的功能和特性，促动脉粥样硬化的发生发展。目前研究已表明血清升高的sPLA2-IIA是造成AS的独立的危险因素，但是其致动脉粥样硬...Abstract Background: Inflammation plays a role in the pathogenesis of cardiovascular disease. A key step in atherogenesis is the extracellular accumulation and modification of apolipoprotein (apo)B–containing lipoproteins in the intima of the arterial wall 。Phospholipase A2s (PLA2s) can catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester of glycerophospholipids . sPLA2-IIA activity can lead to fusion an...学位：医学硕士院系专业：医学院临床医学系_内科学学号：2452009115293

李博

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 学校编码：10384                                            密级       学号：24520091152932       硕  士  学  位  论  文  sPLA2-ⅡA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人主动脉平滑肌细胞MCP-1表达的影响及其机制 Study on the influence of sPLA2-ⅡA on the expression of MCP-1 in human aortic smooth muscle cells induced by oxidized low density lipoprotein and its mechanism  李 博 指导教师姓名： 李卫华 教授专 业 名 称： 心血管内科学 论文提交日期： 2012 年 5 月 论文答辩日期： 2012 年 6 月   2012 年 6 月 PLA2ⅡA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人主动脉平滑肌细胞MCP1表达的影响及其机制李博指导教师李卫华教授厦门大学厦门大学博硕士论文摘要库 学校编码：10384                                            密级       学号：24520091152932      硕  士  学  位  论  文  sPLA2-ⅡA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人主动脉平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白1 表达的影响及其机制  Study on the influence of sPLA2-ⅡA on the expression of monocyte chemoattractant protein-1 in human aortic smooth muscle cells induced by oxidized low density lipoprotein and its mechanism  李 博 指导教师姓名： 李卫华 教授专 业 名 称： 心血管内科学 论文提交日期： 2012 年 5 月 论文答辩日期： 2012 年 6 月  2012 年 5 月  厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活动规范（试行）》。 另外，该学位论文为（          李卫华              ）课题（组）的研究成果，获得（               ）课题（组）经费或实验室的资助，在（               ）实验室完成。（请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。）  声明人（签名）：                       年   月   日       厦门大学博硕士论文摘要库 厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： （     ）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于   年  月  日解密，解密后适用上述授权。 （     ）2.不保密，适用上述授权。 （请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。）  声明人（签名）：                       年   月   日 厦门大学博硕士论文摘要库    厦门大学博硕士论文摘要库摘 要  摘 要 研究背景 动脉粥样硬化是一种动脉壁慢性炎症性疾病，其中含有 apo-B 脂蛋白颗粒在动脉壁的潴留和修饰是动脉粥样硬化发病机制特征之一，而分泌型磷脂酶A2-IIA（secretory phospholipase A2 of group IIA ，sPLA2-IIA）可水解磷酸卵磷脂的 2位酯键， sPLA2-IIA 修饰的 LDL 与蛋白聚糖的亲和力增加，促进脂蛋白潴留，其水解后生成的游离脂肪酸和溶血磷脂，可产生重要的信号分子或进一步成为炎性介质，从而改变内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞的功能和特性，促动脉粥样硬化的发生发展。目前研究已表明血清升高的 sPLA2-IIA 是造成 AS的独立的危险因素,但是其致动脉粥样硬化的作用机制不十分明确。 目的 利用基因体外合成技术，全基因合成人分泌型磷脂酶 sPLA2-IIA 基因片段，构建含人 sPLA2-ⅡA 基因的慢病毒载体，感染人主动脉平滑肌细胞，并研究其在人主动脉平滑肌细胞中的过表达及致动脉粥样硬化炎症作用。 方法 根据 Gene Bank 中 sPLA2-ⅡA 的基因序列，全基因合成人 sPLA2-ⅡA 基因片段，构建含 sPLA2-IIA 基因的慢病毒载体。体外培养人主动脉平滑肌细胞（HASMC），将慢病毒载体感染人主动脉平滑肌细胞，于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，感染后 72h 加入 OXLDL 以及 LY294002 干预，收集人主动脉平滑肌细胞，提取 mRNA，逆转录为 cDNA，Real-time PCR 方法检测 sPLA2-ⅡA mRNA表达水平与炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的 mRNA 表达水平，ELISA 法检测单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的蛋白表达水平。所有数据资料用 Graphpad prism 5.0 统计学分析软件行统计学处理。P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。 结果 1. 扩增出人 sPLA2-ⅡA 基因片段，构建含人 sPLA2-ⅡA 基因的慢病毒载体。测序表明构建的 sPLA2-ⅡA 慢病毒准确； 2. 体外培养人主动脉平滑肌细胞，细胞生长状态良好，慢病毒感染人主动厦门大学博硕士论文摘要库摘 要  脉平滑肌细胞，荧光显微镜下观察发现绿色荧光蛋白的表达，表明慢病毒感染真核细胞成功； 3. 感染 sPLA2-ⅡA 慢病毒的 HASMC 与 ox-LDL 共培养，以及与 ox-LDL+PI3K抑制剂 LY294002 共培养，其中 sPLA2-ⅡA 慢病毒 HASMC+OXLDL 组 MCP-1 的 mRNA及蛋白表达升高（P ＜0.05），而含 LY294002 组 MCP-1 的 mRNA 和蛋白表达水平显著下降，差异具有统计学意义（P ＜0.01）。 结论 本实验证实了sPLA2-ⅡA对 OXLDL的修饰可促进人主动脉平滑肌细胞MCP-1的表达，而 LY294002 可抑制这种效应，以及 PI3K 信号通路参与了 OXLDL 促进MCP-1 表达的作用。   关键词 ：动脉粥样硬化 分泌型磷脂酶 A2-IIA  慢病毒  单核细胞趋化蛋白-1; 磷脂酰肌醇 3-激酶     厦门大学博硕士论文摘要库Abstract  Abstract Background:  Inflammation plays a role in the pathogenesis of cardiovascular disease. A key step in atherogenesis is the extracellular accumulation and modification of apolipoprotein (apo)B–containing lipoproteins in the intima of the arterial wall 。Phospholipase A2s (PLA2s) can catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester of glycerophospholipids . sPLA2-IIA activity can  lead to fusion and enhanced binding of the modified lipoproteins to extracellular proteoglycans. This can increase extracellular deposition of modified lipoproteins。As a result of the hydrolytic activity, sPLA2-IIA releases free fatty acids and lyso-phosphatidylcholine ,These products generate important signaling molecules or many lipid-derived inflammatory mediators , This action may affect the functions and properties of vascular endothelial and smooth muscle cells, and of macrophages. thus contribute to atherogenesis. sufficient accumulated evidence has shown that elevated plasma secretory phospholipase A2 (sPLA2) activity is a strong independent risk factor for coronaryartery disease (CAD)。but the mechanism is unknown。 Objective:  Human sPLA2-ⅡA was synthesized by using the gene synthesis technology in vitro. To construct lentiviruses expressing sPLA2-ⅡA gene. The reconstructed lentiviruses were transfected into Human aortic smooth muscle Cells, and research the expression level of sPLA2-ⅡA in Human aortic smooth muscle Cells and its function of proatherosclerosis. Methods:  Human sPLA2- A was synthesized by wholeⅡ -genome synthesis technology according to the gene sequences from gene bank. Then constructed the lentiviruses expressing sPLA2- AⅡ  gene. Cultured the Human aortic smooth muscle Cells in vitro. The reconstructed lentiviruses were transfected into Human aortic smooth muscle Cells. Observed the expression of green fluorescent protein by fluorescence microscope。After 72 hours，the Human aortic smooth muscle Cells incubated with ox- LDL and LY294002, and then collected. The mRNA was extracted, and then 厦门大学博硕士论文摘要库Abstract  reversed transcription into cDNA. Using the method of RT-PCR, ELISA, the gene and protein of MCP-1 expression levels of each group were detected. Intracellular signaling was investigated by Western blot. All results were statistically analyzed with SPSS 13.0. P<0.05 was considered statistic difference，P<0.01 was considered significantly statistic difference. Results:  1. The human sPLA2- A was synthesized, and the lentivirusⅡ es contain sPLA2- A Ⅱ gene were acquired. The reconstructed lentiviruses of sPLA2- A wⅡ ere confirmed by the sequence analysis and electrophoresis. 2. Cultured the Human aortic smooth muscle Cells in vitro, and the cells growed in good condition. The reconstructed lentiviruses of sPLA2- A Ⅱ were transfected into Human aortic smooth muscle Cells， The green fluorescent protein was observed by fluorescence microscope  which indicated the success of lentiviruses transfection. 3. compared with the control group stimulated by ox-LDL, the expression of MCP-1 in transfected group stimulated by ox-LDL increased (P ＜0.05). compared with the transfected group stimulated by ox-LDL, the expression of MCP-1 in transfected group incubated by ox-LDL and LY294002  decreased ( P< 0. 001) . Conclusions:   sPLA2- A Ⅱ  modified LDL resulted in upregulation of MCP-1 in Human aortic smooth muscle Cells， and LY294002 shows inhibiting effects，this effect is mediated by PI3K/AKT s ignal pathway。  Key words: Atheroscleros is; lentivirus;the secretory phospholipase A2 of group IIA;Monocyte chemoattractant protein-1;Phosphatidylinositol 3-kinase   厦门大学博硕士论文摘要库目 录  目 录 前  言 ..............................................................................................................................................1 实 验 材 料 和 方 法 ..................................................................................................................4 结  果 ............................................................................................................................................18 讨  论 ............................................................................................................................................23 结  论 ............................................................................................................................................29 参考文献 ........................................................................................................................................30 致  谢 ............................................................................................................................................34 附  录 ..........................................................................................................................................35        厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学博硕士论文摘要库Table of Contents  Table of Contents Introduction .....................................................................................................................................1 Materials and Methods ...................................................................................................................4 Results ............................................................................................................................................18 Discussion.......................................................................................................................................23 Conclusion .....................................................................................................................................29 Reference .......................................................................................................................................30 Acknowledgement .........................................................................................................................34 Appendix ........................................................................................................................................35  厦门大学博硕士论文摘要库            厦门大学博硕士论文摘要库英文缩略词表  英文缩略词表 Abbreviations and Acronyms 英文缩写与全称                             中文名称 sPLA2-IIA （secretory phospholipase A2 of group IIA）   IIA 分泌型磷脂酶 A2 sPLA2 （secretory phospholipase A2）                 分泌型磷脂酶 A2 AS  (atherosclerosis)                                动脉粥样硬化性疾病 CAD  (coronary artery disease)                  冠状动脉性疾病 PLA2  （phospholipase A2）                          磷脂酶 A2 MCP-1  （monocyte chemoattactant protein-1）         单核细胞趋化蛋白-1 ICAM-1  （intercellular adhesion molecule-1）          细胞间粘附分子-1 ELISA  （enzyme linked immunosorbent assay）         酶联免疫吸附试验 RT-PCR  (real-time polymerase chain reaction )          实时荧光定量 PCR HASMC (Human aortic smooth muscle Cells)            人主动脉平滑肌细胞 DNA （deoxyribonucleic acid）                       脱氧核糖核酸 cDNA  (complementary deoxyribonucleic acid )          逆转录 DNA RNA  （ribonucleic acid）                           核糖核酸 mRNA  (message RNA)                             信使 RNA GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）    3- 磷酸甘油醛脱氢酶                PBS  （phosphate-buffered saline）                    磷酸盐缓冲盐水 FBS  （fatal bovine serun）                           小牛血清 LDL  (low-density lipoprotein)                         低密度脂蛋白 ox-LDL (oxidized low-density lipoprotein)                氧化型低密度脂蛋白 HDL  (high-density lipoprotein)                        高密度脂蛋白 EDTA (ethylene diamine tetraacetie acid)                 依地酸盐 PI3K (Phosphoinositide 3-kinase)                       磷脂酰肌醇 3-激酶 PKB/AKT (protein kinase B)                           蛋白激酶 B MAPK (mitogen-activated protein kinase)                丝裂原活化蛋白激酶 COX (cyclooxygenase)                               环氧合酶 厦门大学博硕士论文摘要库  厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. 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Study on the influence of sPLA2-ⅡA on the expression of MCP-1 in human aortic smooth muscle cells induced by oxidized low density lipoprotein and its mechanism

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