PKD家族由PKD1，PKD2h和PKD3组成，通常主要分布在胞浆，但在刺激条件下，可转位到各亚细胞结构。这些激酶在生理和病理过程中，具有广泛而重要的作用。包括线粒体氧化应激，T细胞受体信号，心肌基因表达和心肌收缩，细胞凋亡和肿瘤发生等。它们的功能还涉及许多细胞生物学过程，例如高尔基体组织，蛋白运输，高尔基体囊泡分泌以及其他各种细胞信号途径等。 本研究中，我们发现，Hela细胞虽然不表达内源性PKD1，但却能异位表达外源导入的PKD1，并且可以刺激HIV-LTR荧光虫酶报告基因的蛋白表达。然而对HIV-LTR启动子进行各种删除突变，并不能抑制PKD1所刺激的HIV-LTR荧光虫酶报告基因的蛋...The Protein kinase D (PKD) enzymes, which comprise of three isoforms (PKD1/PKDμ, PKD2 and PKD3/PKDυ), are generally localized to the cytosol, but in stimulated cells, they are translocated to various subcellular compartments. These enzymes play numerous roles in a variety of normal and pathological processes including transcriptional response to mitochondrial oxidative stress, T-cell receptor sign...学位：工学硕士院系专业：生命科学学院生物学系_生物化学与分子生物学学号：2172007115410

AWEYA JUDE JUVENTUS

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学校编码：10384                 分类号      密级        学号：21720071154108                        UDC              硕  士  学  位  论  文                                            蛋白激酶 D1（PKD1）在 HIV-1 复制中的作用  The Role of Protein Kinase D 1 in HIV-1 Replication By Aweya Jude Juventus  指导教师姓名:Prof. Chen Ruichuan (陈瑞川) 专  业 名 称：生物化学与分子生物学 论文提交日期：2009 年 5 月 论文答辩时间：2009 年 6 月 学位授予日期：2009 年  月     答辩委员会主席：           评    阅    人：            2009 年   月   蛋白激酶D1（PKD1）在HIV-1复制中的作用        Aweya Jude Juventus      指导教师:Prof. Chen Ruichuan (陈瑞川)                       厦门大学 厦门大学博硕士论文摘要库CERTIFICATION  I Professor Chen Ruichuan (陈瑞川), hereby certify that I have read this manuscript and recommend for acceptance by the Xiamen University a dissertation entitled “The Role of Protein Kinase D 1 in HIV-1 Replication” in fulfillment of degree of Master of Science of Xiamen University.   Signed                      Supervisor Date    School of Life Sciences Xiamen University Xiamen, Fujian P.R. China           厦门大学博硕士论文摘要库 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。                   声明人（签名）：    2009 年   月  日                           厦门大学博硕士论文摘要库DECLARATION  I here declare that apart from the sources cited, this dissertation is my own work under the supervision of my supervisor Professor Chen Ruichuan (陈瑞川). The materials of the dissertation have not been presented and it will not be presented to any other university other than this univerity for similar or any other degree.    Signature:  Candidate: Aweya Jude Juventus              厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学学位论文著作权使用声明  本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于   1、保密（ ），在   年解密后适用本授权书。   2、不保密（  ） （请在以上相应括号内打“√”）   作者签名：      日期：2009 年 5 月 15 日 导师签名：      日期：  年 月 日               厦门大学博硕士论文摘要库COPYRIGHT  All rights reserved. No part of this dissertation may be reproduced, stored in any retrieval system, or transmitted in any from by any means: electronic, mechanical, photographing, recording or otherwise without prior written permission of the author or Xiamen University.     Signature:  Candidate: Aweya Jude Juventus                  厦门大学博硕士论文摘要库DEDICATION  To my dear mum Madam Catherine Aweya who passed away on March 11, 2009 whiles I was working on this thesis.   Mum, you taught me all the good things about life which have thus seen me this far. May your soul and all other departed souls of the family rest in perfect peace. 厦门大学博硕士论文摘要库i  Abstract  The Protein kinase D (PKD) enzymes, which comprise of three isoforms (PKD1/PKDμ, PKD2 and PKD3/PKDυ), are generally localized to the cytosol, but in stimulated cells, they are translocated to various subcellular compartments. These enzymes play numerous roles in a variety of normal and pathological processes including transcriptional response to mitochondrial oxidative stress, T-cell receptor signaling, cardiac gene expression and contractility, apoptosis and carcinogenesis. They are also involved in a number of cellular processes such as regulation of Golgi organisation, protein trafficking, Golgi vesicle fission, and are at the converging point of a number of signal pathways. In this study, we showed that although PKD1 is not expressed in HeLa cells, it could be ectopically expressed and was able to stimulate HIV luciferase activity. However, using deletions mutants of the HIV-1 LTR, we showed that induced expression of HIV-1 by PKD1 did not require TAR and did not also depend on the HIV LTR promoter. On the other hand, in 293T cells, knockdown of PKD1 resulted in the inhibition of HIV-1 expression. Similarly, we also showed that PKD1 did not activate P-TEFb, suggesting that PKD1 may not influence transcription elongation step. Finally, using qRT-PCR tool, we found that overexpresion of PKD1 did not influence the mRNA level of luciferase, suggesting that PKD1 had no effect on RNA transcription. Taken together, by transient transfected system, our results suggest that PKD1 may influence post-transcription steps and may also induce the accumulation of proteins. These findings therefore suggests some probable novel function (s) of PKD1 in cardiac hypertrophy.  Keywords: PKD; HIV-1; Gene expression; Cardiac hypertrophy    厦门大学博硕士论文摘要库ii  摘  要     PKD 家族由 PKD1，PKD2h 和 PKD3 组成，通常主要分布在胞浆，但在刺激条件下，可转位到各亚细胞结构。这些激酶在生理和病理过程中，具有广泛而重要的作用。包括线粒体氧化应激，T 细胞受体信号，心肌基因表达和心肌收缩，细胞凋亡和肿瘤发生等。它们的功能还涉及许多细胞生物学过程，例如高尔基体组织，蛋白运输，高尔基体囊泡分泌以及其他各种细胞信号途径等。    本研究中，我们发现，Hela 细胞虽然不表达内源性 PKD1，但却能异位表达外源导入的 PKD1，并且可以刺激 HIV-LTR 荧光虫酶报告基因的蛋白表达。然而对 HIV-LTR 启动子进行各种删除突变，并不能抑制 PKD1 所刺激的 HIV-LTR 荧光虫酶报告基因的蛋白表达。另一方面，在 293T 细胞中，PKD1，PKD2 和 PKD3均能正常表达，当采用 RNAi 技术抑制 PKD1 表达时，可抑制 HIV-LTR 荧光虫酶报告基因的蛋白表达，从另一个侧面证明 PKD1 对 HIV-LTR 报告基因蛋白表达的影响。此外，我们的结果证明：PKD1 不能激活转录延伸过程中最重要的调控因子—正性转录延升因子b的活性，提示PKD1不能影响基因转录的延伸过程。最后我们的定量 RT-PCR 检测结果显示：PKD1 虽然能够激活 HIV-LTR 荧光虫酶报告基因的蛋白表达，但不能刺激 HIV-LTR 荧光虫酶报告基因 mRNA 的转录。    综上所述，采用瞬转体系，我们的结果提示，PKD1 可能影响了转录后的步骤，并且可能导致蛋白的积累。因此，我们的研究提示，PKD1 在心肌肥大中，可能还有其他新的功能。  关键词：PKD；HIV-1；基因表达，心肌肥大       厦门大学博硕士论文摘要库iii  Table of Contents                     Page Abstract (English) ……………………………………………………………………i Abstract (Chinese) ………………………………………………………………….. ii Table of Contents (English) ……………………………………………………...…iii Table of Contents (Chinese) ………………………………………………...............vi  Abbreviations and Acronyms ………………………………………………………ix List of Illustrations/Figures ………….……………………………….…………..xiii  Chapter One: Introduction and Literature Review ……...……………………..…1 1.1  Overview of Protein Kinase D family …………………………………..…1 1.1.1  Members of PKD family ………………………………………………...…1 1.1.2  Functions of Protein Kinase D Family ……………………………………2 1.2  PKD1 and Cardiac Hypertrophy ………………………………………… 5 1.2.1 Cardiac Hypertrophy ………………………………………………………5 1.2.2  Role of PKD in Cardiac Remodeling and other Cardiac Functions …….7 1.2.3 Role of PKD1 Signaling in Cardiac Hypertrophy …………………….… 8 1.3  PKD1 and HIV Replication …………………………………………….… 9 1.3.1 HIV Latency ……………………………………………………………….. 9 1.3.2 Role of PKD in HIV Replication ………………………………...…….…11 1.4  PKD1 Activity Regulation ……………………………………………..…13 1.4.1 PKD1 Activation …………………………………………………………. 13 1.4.2 Signal Pathways involved in PKD Activation ………………………..… 15 1.4.3 Deactivation of PKD …………………………………………….…….…. 17 1.5  Aim of the Study …………………………………………………………. 18  Chapter Two:  Materials and Methods ………………………………………… 19 2.1  Materials ……………………………………………………….………… 19 2.2  Plasmid Constructs …………………………………….……………...… 19 厦门大学博硕士论文摘要库iv  2.2.1 Transformation and Plasmid DNA Purification ……………………..… 19 2.3  Cell Culture and Transfections ……………………….………………… 19 2.4  Western Blot Analysis …………………………………………………… 20 2.5  Luciferase Assay …………………………………………………….…… 21 2.6  Nuclear Extract (NE) and Immunoprecipitation (IP) …………….…… 21 2.7  Total RNA Extraction …………………………………………….……… 22 2.8  Reverse Transcription (RT-PCR) …………….…………………….…… 22 2.9  Real-time PCR (Quantitative RT-PCR) ………..………………….…… 23 2.10 Recipes of the Media and Reagents used in the Study ………………… 23 2.11 Data Presentation and Statistical Analysis ……………………………... 26  Chapter Three: Results ………………………………………………………….…27 3.1 Comparison of Expression Profiles of PKD Family in HeLa and 293T cells …………………………………………………………………………27 3.2  PKD1 can be Ectopically Expressed in HeLa cells …………………...…27 3.3  Supplementing PKD1 in HeLa cells can Stimulate HIV-LTR Luc Activity ………………………………………………………………….…28 3.4 Knockdown PKD1 in 293T cells inhibits HIV-LTR Luciferase Activity………………………………………………………………….… 28 3.5 PKD1-induced HIV-1 Expression does not Rely on the HIV LTR Promoter ………………………………………………………………..… 29 3.5.1 PKD1-induced HIV-1 Expression does not Require TAR Sequence .… 29 3.5.2  PKD1-induced HIV-1 Expression does not Rely on NF-κB binding sites ……………………………………………………………………...… 30 3.6  Does PKD1 Activate P-TEFb? …………………………………….….… 31 3.7  Does PKD1 Stimulate HIV-1 Transcription? ………………………...… 32  Chapter Four: Discussion and Conclusion …………………………….………... 34 4.1  Discussion ………………………………………….……………………... 34 厦门大学博硕士论文摘要库v  4.1.1  Can PKD1 stimulate HIV-1 transcription? …………………..………… 34 4.1.2  Is the stimulatory effect of PKD1 on HIV-1 Transcription through NF-kB? …………………………………………………………………… 35 4.1.3  Is the stimulatory effect of PKD1 on HIV-1 Transcription Exerted through P-TEFb? ……………………………………………………...… 38 4.2  Does PKD1 really stimulate HIV-1 transcription? ….…………………. 38 4.3  Conclusion …………………………………..……………………………. 39 4.4  Future Work ………………………………..…………………………..… 39  References …..…………………………………………………….…………..…… 40  Acknowledgement ……………………………………………………..………..… 51                  厦门大学博硕士论文摘要库vi  目录 摘要(英文) …………………………………………………………………………... i 摘要(中文)…………………………………………………………………………… ii 目录(英文) ………………………………………………………………………….. iii 目录(中文)…………………………………………………………………………... vi 缩写………………………………………………………………………………….. ix 插图与图片清单…………………………………………………………………... xiii  第一章: 背景介绍与文献回顾………………………………………………………1 1.1  PKD 家族的概况………………………………………………………….…1 1.1.1  PKD 家族成员 ………………………………………………………...……1 1.1.2  PKD 家族功能 ………………………………………………………...……2 1.2  PKD1 与心肌肥大 ……………………………………………..………… 5 1.2.1 心肌肥大 ……………………………………………………………………5 1.2.2  PKD在心脏重塑和其他的心脏功能中的作用……………….……………7 1.2.3 PKD1 信号途径在心肌肥大中的作用………………………...……………8 1.3  PKD1 与 HIV 复制…………………………………..……………………9 1.3.1 HIV 潜伏 ……………………………………………………………………9 1.3.2 PKD 在 HIV 复制中的作用……………………………………………..11 1.4  PKD1 活性调控 ……………………………………………….…………13 1.4.1 PKD1 的活化 ……………………………………………….……………13 1.4.2 PKD 活化中的信号途径……………………………………………….… 15 1.4.3 PKD 的去活化…………………………………………………………..…17 1.5  研究目的 ……………………………………………………..……………18  第二章:  材料与方法 ……………………………………………….…………… 19 2.1  材料…………………………………………………………………………19 2.2  质粒的构建 ……………………………………………….……………… 19 2.2.1 转化与质粒 DNA 的纯化 …………………………………………………19 厦门大学博硕士论文摘要库vii  2.3  细胞培养与转染………………………………………...………………… 19 2.4  Western Blot 分析……………………………………...………………… 20 2.5  Luciferase 分析…………………………………………...……………… 21 2.6  核抽提 (NE) 与免疫共沉淀 (IP)………………………..……………… 21 2.7  全 RNA 抽提…………………………………………….………………… 22 2.8  逆转录(RT-PCR) ……………………………………….………………… 22 2.9  实时 PCR (定量 RT-PCR) ……………………………………………...…23 2.10 研究中用到的溶液与试剂配方…………………...……………………… 23 2.11 数据显示与统计分析………………………………………………...…………26  第三章: 结果 ……………………………………………………………………… 27 3.1  对比PKD家族在 HeLa及 293T 细胞中的表达情况………………..…27 3.2  PKD1 可以在 HeLa 细胞中过量表达……………………………..…… 27 3.3  在 HeLa 细胞中表达 PKD1 可以刺激 HIV-LTR Luc 的活性……….… 28 3.4  在293T 细胞中敲除PKD1会抑制 HIV-LTR Luciferase 活性 …...… 28 3.5  PKD1诱导的HIV-1表达并不依赖HIV LTR 启动子 ……………...… 29 3.5.1 PKD1诱导的HIV-1表达并不需要HIV LTR 序列…………………..…29 3.5.2  PKD1诱导的HIV-1表达并不依赖NF-κB 结合位点 …………….……30 3.6  PKD1 可以活化 P-TEFb? …………………………………………….… 31 3.7  PKD1 可以激活HIV-1转录? …………………………………………… 32  第四章: 总结与讨论 ………………………………………………………...…… 34 4.1  讨论 ………………………………………………………………..………34 4.1.1  PKD1 可以激活 HIV-1 转录吗? ……………………………………..… 34 4.1.2  PKD1对HIV-1转录激活效应是通过NF-kB吗？……………………… 35 4.1.3  PKD1对 HIV-1转录激活效应是通过P-TEFb吗?…………………..… 38 4.2  PKD1真的 可以激活 HIV-1转录吗? ………………………………..… 38 4.3  结论 …………………………………………………………………….… 39 4.4  展望 ……………………………………………………………….……… 39 厦门大学博硕士论文摘要库viii   参考文献…………………………………………………………………..…………40  致谢……………………………………………………………….………………… 51                          厦门大学博硕士论文摘要库ix  Abbreviations and Acronyms 14-3-3 proteins Family of conserved regulatory molecules expressed in eukaryotes AGC   cAMP-dependent, cGMP-dependent and Protein kinase C AIDS   Acquired immune deficiency syndrome AMPK   5' Adenosine monophosphate-activated protein kinase APS   Ammonium persulfate ART   Antiretroviral therapy BCR   B-cell receptor Ca2+/CaMK Calcium/Calmodulin-dependent kinase CaCl2   Calcium chloride cAMP   cyclic adenosine monophosphate CCKB   Cholecystokinin B receptor CDK9   Cyclin-dependent kinase 9 cDNA   complementary DNA CO2   Carbon (IV) oxide or carbon dioxide CRD   Cysteine-rich domain CRM1   Chromosomal region maintenance protein 1 DAG   Diacylglycerol DEPC   Diethylpyrocarbonate DMEM   Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO   Dimethyl sulfoxide DNA   Deoxyribonucleic acid DTT   Dithiothreitol EDTA   Ethylenediaminetetraacetic acid EGFP   Enhanced Green Fluorescent Proteins EGFR   Epidermal growth factor receptor ERK   Extracellular signal-regulated kinase FBS   Fetal Bovine Serum GAPDH  Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations Database”. 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The Role of Protein Kinase D1 in HIV-1 Replication

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