目的：目的检测肾癌组织中和肾癌细胞中Twist、E-cadherin蛋白和mRNA的表达水平其与预后的相关性；探讨Twist、E-cadherin与肾癌临床病理特征的关系。方法：1、通过肾癌细胞（786-0）培养，细胞免疫荧光观察Twist和E-cadherin在786-0内的表达情况。2、RT-PCR检测肾癌组织及癌旁组织TwistmRNA表达情况，观察Twist、E-钙粘蛋白与肾肿瘤临床特征之间的关系。3、采用免疫组化检测40例肾癌组织及40例癌旁肾组织的Twist、E-钙粘蛋白的表达情况，比较两者与肾癌的临床病理分期、分化程度及淋巴结转移之间的关系；结果：1、肾癌组织中Twist、E-c...Objective: The aim of this study was to evaluate the clinical pathology relevance of Twist and E-cadherin Protein and mRNA expression in renal cell cancer. Methods:1、Through the renal cancer cells (786-0) culture, immunofluorescence observation Twist and E-cadherin expression in 786-0. 2、RT-PCR detection of renal cell carcinoma and adjacent tissues Twist mRNA expression observed relationship betw...学位：医学硕士院系专业：医学院_外科学学号：2452010115331

曾祥勇

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学校编码：10384                                     分类号      密级        学    号：24520101153314                                         UDC              硕  士  学  位  论  文    Twist、E-钙粘蛋白在肾癌转移进展中的表达意义 Significance of Twist and E-cadherin expression in the metastatic progression of Renal cell cancer 曾 祥 勇 指导教师姓名： 邢 金 春  教 授 专 业 名 称 ： 外 科 学 论文提交日期： 2 0 1 3 年 4 月 论文答辩日期： 2 0 1 3  年  5 月  学位授予日期： 2 0 1 3 年 4 月                 2013 年 4 月厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学学位论文原创性声明  本人呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学术活动规范（试行）》。      另外，该学位论文为（                        ）课题（组）的研究成果，获得（             ）课题（组）经费或实验室的资助，在（         ）实验室完成。（请在以上括号内填写课题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特别声明。   声明人（签名）：                   年   月   日厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学学位论文著作权使用声明  本人同意厦门大学根据《中华人民共和国学位条例暂行实施办法》等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交学位论文（包括纸质版和电子版），允许学位论文进入厦门大学图书馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： （     ）1.经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于   年  月  日解密，解密后适用上述授权。 （     ）2.不保密，适用上述授权。 （请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。）  声明人（签名）： 年   月   日厦门大博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库摘 要  I摘 要 目的： 目的检测肾癌组织中和肾癌细胞中 Twist、E-cadherin 蛋白和 mRNA 的表达水平其与预后的相关性；探讨 Twist、E-cadherin 与肾癌临床病理特征的关系。   方法： 1、通过肾癌细胞（786-0）培养，细胞免疫荧光观察 Twist 和 E-cadherin在 786-0 内的表达情况。2、RT-PCR 检测肾癌组织及癌旁组织 Twist mRNA 表达情况，观察 Twist、E-钙粘蛋白与肾肿瘤临床特征之间的关系。3、采用免疫组化检测 40例肾癌组织及 40 例癌旁肾组织的 Twist、E-钙粘蛋白的表达情况，比较两者与肾癌的临床病理分期、分化程度及淋巴结转移之间的关系； 结果：1、肾癌组织中 Twist、E-cadherin 蛋白阳性表达率分别为 87.5%、12.5%，癌旁肾组织分别为 32.5%、95.0%，这两个指标表达差异均有统计学意义（P均<0.05）。2、中低分化、晚期、有远处转移肾癌组织中 Twist 表达高于高分化、早期、无侵袭转移的肾癌；中低分化、晚期、有淋巴结转移的肾癌组织中 E-cadherin 表达低于高分化、早期、无侵袭转移肾癌；差异具有统计学意义（P 均<0.05）。3.Twist、E-cadherin mRNA 在肾癌组织中表达量（光灰度比值）分别为 1.48±0.52、0.81±0.23。癌旁正常肾组织中，分别为 1.13±0.37、1.32±0.25。上述各项指标在肾癌组织和癌旁肾组织中的表达相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。4.通过免疫荧光染色发现肾癌细胞（786-0）细胞系中细胞膜和细胞质 Twist 阳性高表达，呈现明显的绿色荧光。E-cadherin 在肾癌细胞系中的表达不明显或较弱。其结果与免疫组化和 RT-PCR 结果一致。 结论：1、在肾癌组织中，Twist 蛋白和 mRNA 表达上调，与细胞免疫荧光的表达一致，提示 Twist 基因与肾癌的发生发展有关；2、肾癌组织中 Twist 蛋白表达上调的同时，上皮性标记分子 E-cadherin 表达下调，提示 Twist 可能与肾癌中的上皮间质转化有关。3、肾癌组织中 Twist 高表达和 E-cadherin 低表达与肾癌的分化程度的分级、分期有关及淋巴结转移有关，与患者的年龄、性别、肿瘤大小无关，提示Twist 及与其可能相关的上皮间质转化与肾癌的侵袭转移进展有关。  关键词:肾癌 Twist E-钙粘蛋白 上皮-间质转化 发病机理厦门大学博硕士论文摘要库厦门大学博硕士论文摘要库Abstract  IIIAbstract Objective:  The aim of this study was to evaluate the clinical pathology relevance of Twist and E-cadherin Protein and mRNA expression in renal cell cancer. Methods:1、Through the renal cancer cells (786-0) culture, immunofluorescence observation Twist and E-cadherin expression in 786-0. 2、RT-PCR detection of renal cell carcinoma and adjacent tissues Twist mRNA expression observed relationship between Twist, E-cadherin and renal tumors clinical features. 3、The relationship between the immunohistochemical detection of 40 cases of renal cell carcinoma and 40 cases of adjacent renal tissue Twist, E-cadherin protein expression, comparing  to the two gene and kidney cancer clinical pathological stage, degree of differentiation and lymph node metastasis; Results: 1. Renal cell carcinoma, Twist and E-cadherin protein positive expression rates were 87.5%, 12.5%, 32.5%、95% in the kidney para-cancerous tissue respectively, two indicators of renal tissue in renal cell carcinoma and para-neoplastic expression differences were statistically significant (P <0.05). 2. Poorly differentiated, advanced, the distant metastatic renal cell carcinoma Twist expression than in well early, invasion and metastasis of renal cell carcinoma; in poorly differentiated, advanced lymph node metastasis of renal cell carcinoma in E-cadherin expression lower than the well-differentiated, early invasion and metastasis of renal cell carcinoma; difference was statistically significant (P <0.05) .3. Twist and E-cadherin mRNA expression in renal cell carcinoma volume (light gray ratio) were 1.59 ± 0.52,0.78 ± 0.13. Kidney tissue adjacent to the cancer were 1.32 ± 0.25,1.02 ± 0.18. Compared to the above indicators expression in renal cell carcinoma and malignant renal adjacent tissue to the differences were statistically significant (P<0.05) .4. Renal cancer cells (786-0) cell lines by immunofluorescence staining found in cell membranes and high expression of cytoplasmic Twist, showing obvious green. E-cadherin expression in renal cancer cell lines is not obvious or weak. Results are consistent with immunohistochemistry and 厦门大学博硕士论文摘要库Twist、E-钙粘蛋白在肾癌转移进展中的表达意义  IVRT-PCR  Conclusion: 1. In renal cell carcinoma, the Twist protein and mRNA expression increase, consistent with the immunofluorescence expression, prompted the the Twist gene with the occurrence of renal cell carcinoma; 2.Renal cell carcinoma Twist protein up-regulation epithelial marker molecules down-regulation of E-cadherin, suggesting that Twist may be associated with renal cell epithelial-mesenchymal transformation . 3.High expression in renal cell carcinoma Twist and E-cadherin decreased expression of the degree of differentiation of renal cell carcinoma grading, staging and lymph node metastasis-related, has nothing to do with the patient's age, sex, tumor size, suggesting that Twist and its likely related to epithelial mesenchymal conversion of progress in invasion and metastasis of renal cell carcinoma.   Keywords:renal cell cancer;Twist; E-cadherin;EMT;pathogenesis厦门大学博硕士论文摘要库目录  V目 录 第一章    前言 ...................................................................................... 1 1、肾细胞癌研究概述 .................................................................................... 1 2、Twist 的机构和功能 ................................................................................. 2 3、Twist 介导的 EMT现象在肿瘤转移中的作用 ........................................... 2 4、EMT 与肿瘤的关系 ..................................................................................... 4 5、本研究的思路、目的和意义 .................................................................... 7 第二章  材料和设备 ............................................................................ 8 1、标本及临床资料 ....................................................................................... 8 2、实验试剂 ................................................................................................... 9 3、主要仪器和设备 ..................................................................................... 13 第三章  实验方法 .............................................................................. 16 1、人肾癌细胞（786-0 细胞）培养 ............................................................ 16 2、肾癌组织中 Twist mRNA 的检测 ............................................................. 18 3、免疫组织化学操作流程 .......................................................................... 24 4、实验结果判定 ......................................................................................... 25 5、统计学方法 ............................................................................................. 26 第四章  实验结果 .............................................................................. 27 1、细胞免疫荧光的荧光显微镜观察结果 ................................................... 27 2、RT-PCR结果 ............................................................................................ 28 3、免疫组织化学结果 .................................................................................. 34 第五章  讨论 ...................................................................................... 40 第六章  结论 ...................................................................................... 45 参  考  文  献 ...................................................................................... 46  厦门大学博硕士论文摘要库Twist、E-钙粘蛋白在肾癌转移进展中的表达意义  VI英文缩略词表 .................................................................................... 51 综述 ................................................................................................... 52 致  谢 ................................................................................................. 64厦门大学博硕士论文摘要库Contents  VII Contents Chapter 1 Introduction ............................................................................ 1 1  Overview of renal cell carcinoma ................................................................. 1 2  Twist structure and functions ....................................................................... 2     3  Twist-mediated EMT phenomenon which the tumor................................. 2 4  The relationship between EMT and tumor ................................................. 4 5  Ideas, purpose and significance of this study   .......................................... 7   Chapter 2 Material and Equipment ........................................................ 8 1  Specimens and clinical data .......................................................................... 8 2  Main reagent and liquid ................................................................................ 9 3  Main instruments and equipment .............................................................. 13 Chapter 3 Experimental Methods ......................................................... 16 1  786-0 cultured human renal cancer............................................................ 16 2  Twist mRNA detection in RCC    ............................................................ 18 3  Immunohistochemistry operation processes ............................................. 24 4  The experimental results determine ........................................................... 25 5  Statistical methods ....................................................................................... 26 Chapter 4 Experimental Results ........................................................... 27 1、Immunofluorescence, fluorescence microscopy results ............................ 27 2、RT-PCR reaction results ............................................................................. 28 3、Immunohistochemistry results ................................................................... 34 厦门大学博硕士论文摘要库Twist、E-钙粘蛋白在肾癌转移进展中的表达意义  VIIIChapter 5 Discusses ................................................................................ 40 Chapter 6 Conclusions ............................................................................ 45 References ................................................................................................ 46 Abbreviation ............................................................................................ 51 Review ...................................................................................................... 52 Acknowledgments ................................................................................... 64厦门大学博硕士论文摘要库第一章  前言  1第一章  前言 1、肾细胞癌研究概述 肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)，是起源于肾小管上皮细胞的一组恶性肿瘤。肾癌的发病率达8.9/10万,一种常见成人的泌尿系统恶性肿瘤之一，目前呈逐年增加趋势。肾癌发病率占全身恶性肿瘤的3％。肾癌的发病男性多于女性，男女比例大约3.5:1，常发生于中老年人，偶发30岁以下。在病理上75％表现为透明细胞癌，起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，占肾脏恶性肿瘤的80%-90%。Hahn WC[1]等证明了肾小管上皮细胞多阶段一系列的复杂基因突变导致了透明细胞癌的发生。在我国，肾癌是泌尿系统中发病率仅次于膀胱癌的恶性肿瘤。世界范围内肾癌的发病率以平均每年2.5%的速度增加,肾癌的死亡病例每年超过100 000例。 大约三分之一肾透明细胞癌病人在诊断时通常已经转移了而无法接受手术治疗， 终三分之一的病人呈现局部肿瘤复发。尽管近期使用多基因抑制剂，透明细胞肾癌始终存在内在治疗的抵抗。目前肾癌的主要治疗方法是外科手术根治，但既使早期患者手术治疗后，仍有部分患者将发生转移。术后复发率高达20%-40%。肾癌容易发生转移的部位是淋巴结、肺、骨、脑等器官。转移性肾癌预后较差，中位生存期6-12个月，5年生存率小于10%，对放化疗等治疗不敏感[2]。 因此，非常有必要深入了解肾细胞癌的发生、发展及浸润、转移等发病机制，对肾癌的早期诊断及治疗方案的选择有十分重要意义。 随着基础研究和临床诊疗技术的进步，现在肾癌患者往往可以在更早期的阶段便能得到诊断，从而获得更及时的治疗和改善预后。然后，我们至今缺乏在一种早期、高敏度性和高特异性的诊断肾癌的有效方法，通常是在B超体检和CT、MRI 在诊断其他疾病时偶然发现肾癌，这一现象目前具有增多趋势，而且很多在中青年患者中发现，这使得部分病人在确诊肾癌时已发生远处转移，这一提示我们寻找一种理想的肾癌特异性早期诊断的基因肿瘤标记物，是将来的研究方向之一。如何逆转肿瘤细胞对周围的浸润进展及远处转移，从而大大改善患者的预后，是目前肿瘤研究的热点难点。疾病重在预防，对于肿瘤来说也同样重要，通过进一步探索肿瘤早期发生发展的潜在机制，可预防肿瘤的发生发展和相应降低其发厦门大学博硕士论文摘要库Twist、E-钙粘蛋白在肾癌转移进展中的表达意义  2病率提供理论依据。 2、 Twist 的机构和功能 Twist基因首先在果蝇中发现的，科学家随后相继在线虫、水蛭、文昌鱼、斑马、水母、大鼠、小鼠以及人类中被得到证实，主要编码碱性的螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）DNA结合的转录因子，是一个不同种属的核苷酸和氨基酸序列高度保守的转录因子，在进化过程中被发现的[3]。脊椎动物的bHLH具有84%-100%的同源性。Twist在不同的种属分别由202氨基酸（人）、490个氨基酸（果蝇）206个氨基酸（小鼠）序列构成，其中小鼠和人类的氨基酸序列具有96%的同源性，并且在不同的种属中其DNA结合区域具有100%的序列保守，即能结合一种E-box的DNA序列。在bHLH蛋白当中，Twist转录因子是惟一功能是形成功能性的同源和异源性结构。这两类复合体被发现显示出显著不同，甚至对抗，胚胎形成和中胚层形成出现了Twist的作用。此外，Twist蛋白直接与其他许多转录因子有关，包括MyoD,MEF2，RUNX1，RUNX2，PGC1-α，P53和抑制其激活作用[4]。  Twist蛋白分子量为26KD，等电点为为9.591。Twist在胚胎形成和中胚层来源的组织和细胞类型中的高表达，在胚胎发育中形成发挥重要的作用。在动物胚胎发育的特定过程中，Twist在介导细胞组织的EMT过程，导致细胞移动和组织塑造中起主要的作用。越来越多的研究表明，肿瘤操纵Twist的胚胎功能，赋予癌基因和转移特征。Twist可导致血管内皮因子（VEGF）的生成，继而导致肿瘤血管的生成。Twist分为Twist1和Twist2在家族蛋白角色中等出现各种各类固定人类肿瘤中，能够促进原发肿瘤生长的形成，癌细胞播散和化疗药物的抵抗。更多的研究证明，Twist的生物性和癌基因功能有助于肿瘤的生长。 3、Twist 介导的 EMT 现象在肿瘤转移中的作用 近年来研究发现，Twist基因是在进化过程中的一个保守转录因子，它属于螺旋一环一螺（basic- helic-loop-helix, bHLH )转录因子家族，可调节胚胎发育过程中的细胞重建，并赋予细胞迁移的能力[3]。研究发现，人类机体恶性肿瘤的发生发展是细胞调控的癌基因与抑癌基因相互作用的结果，多基因变化导致细胞周期的混乱，从而导致细胞失控性生长。近几年来对于癌基因和抑癌基因的研究成厦门大学博硕士论文摘要库Degree papers are in the “Xiamen University Electronic Theses and Dissertations 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Significance of Twist and E-cadherin expression in the metastatic progression of Renal cell cancer

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