研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平,可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据.本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR-EGFP同时感染不同的哺乳动物细胞株,利用流式细胞仪检测EGFP的表达强度.共使用20种哺乳动物细胞株,其中10种人类组织细胞,2种猴组织细胞,8种小鼠组织细胞.结果表明,重组痘苗病毒WR-EGFP对鼠细胞系BHK21和人细胞系A-549的感染效率和表达效率最佳;整体看,痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞;对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞;但没有特别的组织偏嗜性

何水珍

吴婷

夏宁邵

张军

欧山海

程通

陈敏

Xiamen University Institutional Repository

第 44 卷  第 6 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol. 44 No. 6 2005 年 11月 Journal of Xiamen U niversity ( Natural Science) Nov. 2005 重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及 EGFP 表 达 水 平 研 究  收稿日期: 2004-11-03基金项目:福建省科技重大专项( 2004YZ01)资助作者简介:吴婷( 1973- ) ,女,博士.* 通讯作者: ns xia@ j ingxian. xmu. edu. cn吴  婷,欧山海,陈  敏,程  通,何水珍,张  军,夏宁邵*(厦门大学福建省医学分子病毒学研究中心,福建 厦门 361005)摘要: 研究重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达水平,可为痘苗病毒表达系统宿主细胞的正确选择提供依据.本研究利用重组绿色荧光蛋白基因的痘苗病毒WR-EGFP 同时感染不同的哺乳动物细胞株, 利用流式细胞仪检测EGFP 的表达强度. 共使用 20 种哺乳动物细胞株,其中 10 种人类组织细胞, 2 种猴组织细胞, 8 种小鼠组织细胞. 结果表明,重组痘苗病毒 WR-EGFP对鼠细胞系 BHK21 和人细胞系 A-549 的感染效率和表达效率最佳; 整体看, 痘苗病毒对多数灵长类动物细胞的感染效率和表达效率优于鼠细胞; 对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞; 但没有特别的组织偏嗜性.关键词: 重组痘苗病毒;绿色荧光蛋白;流式细胞仪中图分类号: R 373     文献标识码: A      文章编号: 0438-0479( 2005) 06-0866-04  痘苗病毒属于痘病毒科, 正痘病毒属,在人类彻底消灭天花的战斗中一直作为疫苗广泛使用并发挥了关键作用.痘病毒是目前发现的所有病毒中最大、最复杂的一类病毒.在表达外源基因的各种重组病毒载体中,痘病毒可容纳外源基因的长度和数量最大[ 1] ,因此有大量的研究将痘苗病毒用于发展高效、安全而且价廉的新型重组活疫苗[ 2~ 4] , 其中有些已进入临床试验阶段.痘苗病毒的另一个重要用途是作为高效表达外源基因的载体,用于获得真核表达重组蛋白产品 [ 5] .已有研究证实在实验室中痘苗病毒能在兔肾及睾丸、鸡胚、牛胚、HeLa和换代细胞及其他多种细胞上繁殖[ 6],但平行定量比较痘苗病毒对多种常用哺乳动物细胞株的感染效率及在不同细胞中的表达效率的研究仍十分少见. 本研究平行比较了重组痘苗病毒对多种哺乳动物细胞的感染效率及表达效率, 为痘苗病毒表达系统的合理使用提供理论和实验依据.1  材料和方法1. 1  材  料( 1) 细胞株、病毒和质粒CV-1、293、143B、H epG2、PLC/ PRF/ 5、WI-38、DMS-114、JC、L-929、P815、TIB75 细 胞 株 购 自ATCC; H ela、CHO、NIH3T 3、Raji、BHK21、A-549、PA317、Vero-E6、LCL-cm 细胞株由本实验室保存.重组痘苗病毒WR株和重组痘苗病毒用载体 pV 由香港大学 Ng 教授实验室惠赠.携带增强型绿色荧光蛋白基因的质粒 pEGFP 购自 Clontech公司.( 2) 仪  器荧光倒置显微镜为 Nikon Diaphot 300型,流式细胞仪为 Beckman Coulter EPICS XL.1. 2  方  法( 1)用于重组痘苗病毒 WR-EGFP 的载体 pV-EGFP 的构建用限制性内切酶 SmaI 和 S tuI 酶切质粒 pEG-FP, 回收约 750 bp 的片断, 插入经限制性内切酶SmaI 线性化的载体 pV 中,即位于痘苗病毒早晚期启动子 P7. 5的下游,酶切鉴定, 确定 EGFP 基因与启动子方向一致.( 2) 重组痘苗病毒的构建、扩增及病毒滴度测定参照文献[ 2] . 野生痘苗病毒 WR 感染 CV-1 细胞, 37 e 2 h 后转染 pV-EGFP 质粒 (按产品说明操作) , 48 h后刮下细胞, 冻融 3 次, 作为重组病毒 WR-EGFP 储存液.将重组病毒储存液稀释不同倍数后感染 143B细胞, 48 h 后挑取蓝色空斑, 进一步用 CV-1细胞扩增.获得的病毒用 CV-1细胞测定病毒滴度.( 3) 重组痘苗病毒感染哺乳动物细胞哺乳动物细胞用胰酶消化吹散后铺 24孔培养板,每孔细胞数量约为 1 @ 105 . 37 e 培养 12 h 后弃去原培养基, PBS 洗 1次, 分别加入 1 @ 103、1 @ 104、1 @ 105PFU 的WR-EGFP 和 1 @ 105 PFU 的痘苗病毒 WR,37 e 培养 2 h后更换为2%的原培养基, 继续培养 24 h和 48 h后进行观察和检测.( 4) 流式细胞仪检测病毒感染效率及阳性细胞平均荧光强度待检测的细胞经胰酶消化并吹散为单细胞悬液,细胞悬浮液经 200目的尼龙网过滤后使用流式细胞仪检测, 激发波长为 488 nm, 检测波长为 525 nm , 用EXPO32软件对采集的数据进行分析.2  结  果2. 1  痘苗病毒对不同哺乳动物细胞的感染效率及表达效率比较用 MOI 0. 01、0. 1和 1的携带 EGFP 报告基因的重组痘苗病毒WR-EGFP 对 10种人细胞、2种猴组织细胞以及 8种小鼠细胞进行感染,在 48 h后利用流式细胞仪计算细胞发出绿色荧光的百分比(细胞感染率)和平均荧光强度(表 1,结果为 3次实验的平均值) .结果表明, 在各种哺乳细胞株中, 痘苗病毒对鼠BHK21和人 A-549细胞的感染效率及表达效率均最高,甚至仅以 MOI 0. 01的低剂量即可达到 90%以上的感染率,当以 MOI 0. 1以上剂量感染时感染率接近100% ,平均荧光强度在 400 以上. 痘苗病毒对 143B的感染效率与 BHK21和 A-549接近, 而表达效率稍低一些,但也明显高于其他细胞.对 PLC/ PRF/ 5、WI-38、HepG2、Hela和 DMS 114细胞在 MOI I 剂量时也在 90%左右, 表达效率稍低一些, 荧光强度在 200~300左右.痘苗病毒对两株悬浮细胞( LCL- cm 和 Raji)的感染效率和表达效率均很低,即使以 MOI 1的高剂量感染,也仅能达到 30%左右的感染率, 感染细胞内的平均荧光强度仅为 50左右. 293细胞是人贴壁细胞中唯一低表达的细胞,虽然感染效率可达 80%左右,但感染细胞的平均荧光强度仅为 60. 0,与两株悬浮细胞( LCL- cm和Raji )相当. 在2株猴贴壁细胞株中, 病表 1  重组痘苗病毒WR-EGFP 对不同细胞系的基因转移效率及表达效率Tab. 1  Efficiency of g ene- tr ansfer and gene-expression of recombinant v accina v irus WR-EGFP in different cell lines细胞株   组织来源       特 征转染效率( % ) *MOI= 0. 01 MOI= 0. 1 MOI= 1平均荧光强度*MOI= 0. 01 MOI= 0. 1 MOI= 1人A-549 肺癌 粘附 93. 8 98. 7 98. 9 326. 0 453. 3 467. 7143B 骨肉瘤 粘附 96. 5 98. 5 98. 6 230. 7 277. 7 363. 0PLC/ PRF / 5 肝癌 粘附 89. 9 96. 6 95. 4 188. 3 273. 7 274. 7WI-38 胚肺 粘附 80. 3 93. 1 98. 0 142. 0 178. 0 244. 3H epG2 肝癌 粘附 73. 7 92. 3 99. 8 157. 5 227. 8 323. 0H ela 宫颈癌 粘附 67. 0 84. 4 87. 5 150. 7 303. 0 384. 0DMS114 肺癌 粘附 22. 0 75. 0 89. 1 60. 5 148. 0 201. 0293 胚肾 粘附 58. 4 78. 8 83. 8 81. 0 85. 7 60. 0LCL-cm 永生化 B 淋巴细胞 悬浮 0. 5 6. 0 28. 7 26. 5 40. 0 53. 0Raji Burkitt淋巴瘤 悬浮 0. 8 9. 9 24. 9 33. 7 43. 6 50. 9猴CV-1 肾脏 粘附 92. 2 98. 6 99. 1 363. 7 441. 3 358. 3Vero-E6 肾脏 粘附 4. 0 20. 5 76. 1 14. 0 22. 7 24. 5啮齿类BHK21 肾脏 粘附 96. 8 99. 6 99. 9 429. 0 446. 3 482. 0T IB75 肝脏 粘附 29. 7 72. 1 91. 9 92. 0 136. 5 271. 0JC 乳腺癌 粘附 4. 6 27. 3 90. 7 95. 0 122. 0 228. 0PA317 胚胎成纤维 粘附 2. 9 22. 3 60. 1 37. 0 49. 0 50. 0NIH 3T3 胚胎成纤维 粘附 3. 3 22. 8 68. 5 23. 5 22. 4 28. 0L-929 皮下结缔组织 粘附 2. 8 12. 9 59. 5 8. 7 9. 2 16. 3CH O 卵巢 粘附 0. 7 8. 0 50. 2 9. 3 9. 2 13. 1P815 肥大细胞 悬浮 0. 1 0. 7 11. 0 4. 9 14. 9 12. 5   * :结果为 3 次实验的平均值.#867#第 6 期       吴  婷等:重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及 EGFP表达水平研究毒对 CV-1的感染率和表达效率很高,与人 143B细胞相当,但对 Vero-E6 细胞的感染率较低, 表达效率尤其低,甚至低于人悬浮细胞.虽然鼠 BHK21细胞是所检测细胞系中感染效率和表达效率均最高的细胞系之一, 但与灵长类动物细胞相比,痘苗病毒对多数鼠细胞系的感染效率和表达效率均要差许多.其中 T IB75 细胞和 JC 细胞相对较好,在用高剂量病毒感染时, 能获得 90%左右的感染率,感染细胞的平均荧光强度也可达到 200~ 300的水平.而病毒对其他 4株鼠贴壁细胞即使以 MOI 1的病毒感染,感染率也仅能达到 60%左右, 平均荧光强度低于 50.病毒对鼠悬浮细胞 P815的感染效率最低,MOI 1病毒感染的感染率仅 11. 0% ,平均荧光强度仅12. 5%.2. 2  重组痘苗病毒基因转移效率与细胞组织器官来源的关系将重组痘苗病毒对同一种属内不同组织器官来源细胞的基因转移效率进行比较,从表 1的结果可看出,痘苗病毒对不同组织来源细胞株的基因转移效率和表达效率可以十分接近, 例如肾来源 BHK21 细胞和肺来源的 A-549 细胞, 肝癌细胞 PLC/ PRF/ 5和肺纤维母细胞WI-38( SV40转化的肺成纤维细胞) ; 而对同一组织器官来源的不同细胞株的基因转移效率可存在明显差别,例如对猴肾细胞 CV-1和 Ver o-E6等.因此可以认为痘苗病毒对哺乳动物细胞的基因转移效率与细胞的组织来源没有明显的必然联系.3  讨  论痘苗病毒已被广泛应用于疫苗载体及重组蛋白表达,但平行定量比较痘苗病毒对多种常用哺乳动物细胞株的感染效率及表达效率的研究仍十分少见.由于目前有痘苗病毒、杆状病毒、腺病毒、逆转录病毒、脂质体转染等多种方法介导外源基因在哺乳动物细胞中的表达,在为某种细胞株选择基因转移载体时往往缺乏研究数据做比较. 本研究以重组痘苗病毒WR-EGFP为模式病毒,分析痘苗病毒对 20种常用细胞株的感染效率和 EGFP 表达水平, 结果表明, 重组痘苗病毒WR-EGFP 对鼠细胞系 BHK21和人细胞系 A-549的的感染效率和表达效率最佳,这两种细胞是利用痘苗病毒在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的很好选择. 整体上看,痘苗病毒WR株的感染效率和表达效率对多数灵长类动物细胞可有很好的感染效率和表达效率,而对多数鼠细胞的感染效率和表达效率较差.对贴壁细胞的感染效率和表达效率明显优于悬浮细胞,但对不同组织来源的细胞没有特别的偏嗜性. 该结果对于我们为某种细胞株选择最佳的基因表达载体具有指导意义.研究过程中我们发现 MOI为 0. 01、0. 1和 1的重组痘苗病毒WR-EGFP 感染细胞后 24 h,它们的感染效率和表达效率有较大差别, 但经过 48 h 的孵育, 这种差别变得很小(结果未显示) ,这些结果提示,在利用重组痘苗病毒系统大量表达外源蛋白时, 可通过降低病毒滴度,延长孵育时间的办法达到节省病毒的目的.在真核蛋白表达中, 另一常用系统为昆虫杆状病毒系统[ 7, 8] .不久前我们曾用类似的细胞株平行比较过重组昆虫杆状病毒的基因转移及表达效率[ 9, 10] . 与昆虫杆状病毒相比, 重组痘苗病毒同样是对贴壁细胞的感染率和表达效率明显优于悬浮细胞, 对灵长类细胞明显优于小鼠细胞. 不同的是昆虫杆状病毒需以MOI 50的高剂量才能对敏感细胞有较高的感染率,感染率最高不超过 90% ,感染 48 h后感染细胞的平均荧光强度最高仅 227. 8, 多数低于 100. 而痘苗病毒对多数敏感细胞仅以 MOI 0. 01的低剂量即可获得超过90%的感染率, 用 MOI 0. 1 剂量病毒可获得接近100%的感染率,而感染 48 h后感染细胞的平均荧光强度最高可大于 400, 大多数在 200以上.但痘苗病毒WR株的一个缺陷是对多数敏感细胞, 在病毒感染细胞 72 h左右即会导致大多数细胞死亡, 而昆虫杆状病毒感染的细胞可较长时间存活. 因此如何选择合适的哺乳动物细胞表达系统, 还需根据实验的目的进行具体分析.参考文献:[ 1]  Carr oll M W, Moss B. 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P ro g. , 2003, 19( 1) : 130- 136.#868# 厦门大学学报(自然科学版)                   2005 年[ 6]  闻玉梅. 现代医学微生物学[ M ] . 上海: 上海医科大学出版社, 1999. 872- 885.[ 7]  Kost T A , Condreay J P. Recombinant baculov iruses asmammalian cell g ene-deliv ery vector s[ J] . T rends Bio tech-no l. , 2002, 20( 4) : 173- 180.[ 8]  H user A, Ho fmann C. Baculo virus v ecto rs: no vel mamma-lian cell gene-deliv ery vehicles and their applications [ J] .Am. J. 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In this study , differ ent MOI of recombinant v accinia virusWR-EGFP w ere used to infect sever al differ ent mammalian cell lines simultaneously, after 48 h p. o. i. , and flow cy tometer w as usedto detect the intensity of gr een fluor escence emitted by GFP. Tw enty different mammalian cell lines were infected, including 10 humancell lines, 2 monkey cell lines and 8 rodent cell lines. Results show ed that r ecombinant vaccinia virus WR-EGFP could infect hamsterkidney cell BH K21 and human cell A-549 w ith the highest infection eff iciency and expression efficiency. Fo r most primat e cell lines,WR-EGFP has higher infect ion efficiency and expression efficiency than r odent cell lines, and both efficiencies a re higher in adherentcultur e cell lines t han in suspend cult ur e cell lines, but no obv ious par tiality w as observed fo r cells coming fr om differ ent or gan o rigin.At 24 h p. o. i. , different MOI of WR- EGFP infected cell and expressed GFP with markedly different intensit y, but at 48 h p. o. i. , thediffer ence became neg lig ible, which implies lower dosage of virus and longer culture can be used to expr ess t arg et pro teins. Comparingwith baculo vir uses, v accinia v irus has higher infection and expression efficiency in mammalian cell lines w ith low er MOI, but may ly sismost cell lines after 72 h p. o. i. , w hich seldom happen w hen infecting w ith baculov iruses.Key words: vaccinia v irus; g reen fluor escent protein; flow cy tometer#869#第 6 期       吴  婷等:重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及 EGFP表达水平研究

重组痘苗病毒对不同哺乳动物细胞株的感染效率及EGFP表达水平研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21225/%e9%87%8d%e7%bb%84%e7%97%98%e8%8b%97%e7%97%85%e6%af%92%e5%af%b9%e4%b8%8d%e5%90%8c%e5%93%ba%e4%b9%b3%e5%8a%a8%e7%89%a9%e7%bb%86%e8%83%9e%e6%a0%aa%e7%9a%84%e6%84%9f%e6%9f%93%e6%95%88%e7%8e%87%e5%8f%8aEGFP%e8%a1%a8%e8%be%be%e6%b0%b4%e5%b9%b3%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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