鼠源单克隆抗体MA18 7是特异识别乙型肝炎病毒 (HBV)pre S1抗原的中和抗体。为表达MA18 7的小分子抗体 ,将MA18 7的重链可变区基因 (VH)和轻链可变区 (VL)基因分别克隆到原核表达载体pTO T7进行原核表达。结果VH 和VL 均以包涵体的形式高效表达 ,包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度 >90 %的重组抗体片段。生物传感器、竞争ELISA和间接ELISA测定均显示 ,VH 或VL 均不能结合相应抗原 ,但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体Fv,表明MA18 7的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组

吴婷

夏宁邵

张军

程通

管宝全

罗文新

陈敏

Xiamen University Institutional Repository

20 卷 6 期2004 年 11月生  物  工  程  学  报Chinese J ournal of BiotechnologyVol. 20  No. 6November  2004 收稿日期: 2004-03-26, 修回日期: 2004-07-01。基金项目: / 8630计划海洋生物技术主题青年基金( No. 2001AA628120)。* 通讯作者。  Tel: 86-592-2184110; E-mail : zhangj@ jingxian. xmu. edu. cn乙型肝炎病毒 pre-S1区中和抗体可变区的原核表达管宝全  张  军*  罗文新  陈  敏  吴  婷  程  通  夏宁邵(厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,厦门  361005)摘  要  鼠源单克隆抗体MA18P7 是特异识别乙型肝炎病毒( HBV) pre- S1 抗原的中和抗体。为表达MA18P7 的小分子抗体,将MA18P7 的重链可变区基因( VH )和轻链可变区 ( VL )基因分别克隆到原核表达载体 pTO-T7 进行原核表达。结果 VH 和 VL 均以包涵体的形式高效表达, 包涵体经过变性、复性及金属离子亲和纯化后获得纯度> 90%的重组抗体片段。生物传感器、竞争 ELISA 和间接 ELISA测定均显示, VH 或 VL 均不能结合相应抗原, 但二者体外混合后可迅速非共价结合形成具有良好活性的可变区抗体 Fv ,表明MA18P7 的抗原结合活性区由重链可变区和轻链可变区共同组成。关键词  乙型肝炎病毒, 中和抗体, 可变区, 表达中图分类号  Q786   文献标识码  A   文章编号 1000- 3061( 2004) 06-0901- 05  由乙型肝炎病毒(HBV)感染引发的急性肝炎、慢性肝炎乃至肝硬化和肝癌已经成为人类所面临的最为严重的健康问题之一。HBV pre-S1蛋白含有肝细胞结合位点,与侵入肝细胞有关[ 1]。已有研究表明pre-S1的 aa21-47肽段是HBV特异结合肝细胞的主要位点[ 2]。部分乙肝患者能针对此肽段诱导保护性免疫反应[ 3]。抗 pre-S1 aa21-47 抗体参与病毒的清除和中和,具有保护作用,被认为是预示乙肝患者康复的重要标志[ 4]。Heermann等[ 5- 7]获得的鼠源单克隆抗体MA18P7,识别的抗原表位位于 aa21-47区内,是具有体内中和能力的中和抗体。鼠源单抗直接应用于人体会导致人抗鼠抗体反应 (HAMA) , 大大限制了其应用。通过基因工程的手段, 对现有的鼠源单抗进行改造, 研制能够保持亲本抗体特异性和亲和力的小分子可变区抗体,是降低HAMA 的方法之一。抗体的重链可变区 ( VH ) 和轻链可变区(VL )通过非共价键结合在一起( Fv) , 是抗体中具有完整抗原结合活性的最小功能片段。本研究利用大肠杆菌分别表达 MA18P7的可变区抗体片段 VH 和VL, 体外结合形成Fv片段, 结果表明MA18P7抗体片段VH 或VL 均不具抗原结合活性,而 Fv 则具有良好的抗原结合活性, 为进一步利用小分子抗体进行HBV的抗体治疗奠定了基础。1  材料和方法111  细胞、菌株和质粒可分泌抗 HBV pre-S1单克隆抗体 4D11的鼠杂交瘤细胞系和可分泌抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆抗体 8C11的鼠杂交瘤细胞系由本实验室制备;大肠杆菌 DH5A株和ER2566株由本室保存;质粒 pTO-T7由本室构建保存[ 8], 载体 pMD18-T 购自大连宝生物工程有限公司。112  酶及其它生化试剂限制酶购自大连宝生物工程有限公司, T4 DNA连接酶购自华美生物工程有限公司, DNA柱式胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司, PCR 用 Taq酶、dNTP 购自上海生工生物工程公司。HBV pre-S1抗原 CI由本室表达纯化。基因合成、引物合成以及测序均由上海博亚生物技术有限公司完成。113  抗 HBV pre-S1 单克隆抗体 MA18P7重链、轻链可变区基因的获得根据MA18P7的重链可变区序列 ( GenBank登录号: AJ002098)和轻链可变区序列 ( GenBank登录号:AJ002099) ,分别合成两段可变区全基因。设计引物如表 1所示。以合成基因片段为模板,分别扩增重链 VH 和轻链 VL 基因, 扩增条件是 94 e 预变性 5min,然后按照 94 e 35s, 55 e 35s, 72 e 40s 进行 30个循环, 最后 72 e 延伸 10 min。回收两种 PCR产物,连接 pMD18-T 载体后用 EcoR Ñ单酶切筛选目的基因反向插入 pMD18-T 的阳性克隆并测序。表 1  VH 和 VL 两端的引物*Table 1 The primers of VH and VLPeptide Primer sequenceVHF 5c-GAA TTC GAT GTG CAG CTT CAG GAG-3cVHR 5c-AAG CTT TGC AGA GAC AGT GAC CAG-3cVLF 5c-GAA TTC GAC ATT GAG ATG ACC CAG-3cVLR 5c-AAG CTT TTT CAG CTC CAG CTT G-3c* 画线部分为加入的酶切位点114  MA18P7重链可变区、轻链可变区原核表达载体的构建取正确连入 pMD18-T 的阳性克隆质粒,用 EcoRÑ和 Hind Ó 酶切,回收目的片段。将质粒 pTO-T7[ 8]用 EcoR Ñ和 Hind Ó 双酶切并回收载体, T4 DNA连接酶连接载体和目的片段。转化后小量提取质粒,用 BamH Ñ和Hind Ó 酶切鉴定,阳性克隆即为重组原核表达载体 pTO-T7-MA18P7-VH 和 pTO-T7-MA18P7-VL。115  MA18P7可变区抗体片段的表达与初步纯化重组表达质粒 pTO-T7-MA18P7-VH 和 pTO-T7-MA18P7-VL 分别转化 E . coli ER2566菌株, 挑取单菌落于 3mL LB(含Kan 100LgPmL)培养基中, 37 e 振荡培养过夜,转接菌液于 500 mL LB(含Kan 100 LgPmL)培养基中, 37 e 振荡培养过夜, 当菌液的 OD 600值达018左右时加入 012 mmolPL 的 IPTG诱导,诱导条件为37 e , 4h。离心收集菌体, 超声破碎后再次离心以分离包涵体沉淀和上清。沉淀先后用 Buffer I( 20mmolPL Tris-Cl, pH815, 100 mmolPL NaCl, 5 mmolPLEDTA)和 2% Triton 洗涤后溶于含不同浓度尿素的Buffer I 中。稀释至蛋白浓度约100 LgPmL,用浓度较低的尿素透析并不断减少尿素含量直至将蛋白透析到PBS中,以 PEG20000浓缩透析后样品, 得抗体片段初步纯化产物。对纯化过程中各部分样品进行SDS-PAGE分析。116  抗体片段的金属离子亲和纯化取适量 Talon His树脂( Clontech公司) , 以 10倍柱体积的 PBS平衡后加入抗体片段初步纯化产物,室温结合 1h后收集穿透峰, 加入洗涤缓冲液(含 5mmolPL咪唑的 PBS, pH 710)去除杂蛋白后加入洗脱缓冲液(含 150 mmolPL 咪唑的 PBS, pH 710)分部收集目的蛋白,对 PBS透析后获得较高纯度的蛋白。117  生物传感器测定抗体片段的抗原结合活性应用 BIACORE X生物传感器( BIAcore 公司)。在 CM5芯片上偶联重组 HBV pre-S1 抗原[ 9]。分别测定抗体片段 VH 和VL 的浓度,经过计算调整使二者的摩尔浓度相同, 等体积的 VH 和 VL 混合后在37 e 温育 4h。将等摩尔浓度的 VH、VL 及 VH 和 VL的混合物等样本加入生物传感器, 测定各样本与pre-S1抗原的结合活性。118  竞争 ELISA测定抗体片段的活性以HBV pre-S1 aa21-47 合成多肽 1 LgPmL 包被聚苯乙烯板, 1% BSA 封闭非特异结合位点, 每孔加入 50LL 不同待测样本(抗体片段MA18P7-VH、MA18P7-VL、或 VH 和 VL 等量混合物 ) , 以 PBS、4D11 和8C11为对照, 再加上 50LL 按 1B1000稀释的 4D11-HRP, 37 e 温育 1h后用 PBST 洗涤,加入显色底物显色, 以酶标仪测定 OD 450P620。119  间接法 ELISA测定抗体片段的活性将MA18P7-VH 和MA18P7-VL 等量混合后的混合物用 PBS调整至浓度为 1mgPmL 后进行梯度倍比稀释,分别加 100LL 到以 aa21-47 多肽 1LgPmL 包被的聚苯乙烯板中, 37 e 孵育 1h, PBST 洗 5次后扣干,再每孔加入100LL 1B2500稀释的HRP标记 ant-i 6His抗体( Amersham Pharmacia) , 37 e 孵育 015h, 加入显色底物显色 15min后终止, 以酶标仪测量 OD 450P620。2  结果211  MA18P7重链可变区、轻链可变区原核表达载体的构建通过引物在基因两端分别引入 EcoR Ñ和HindÓ酶切位点后,两段目的基因分别连接到同样酶切处理的载体 pTO-T7中, 即得到原核表达载体 pTO-T7-MA18P7-VH 和 pTO-T7-MA18P7-VL (图 1)。pTO-T7在多克隆位点之后含有 6个组氨酸( His)标签。测序结果证实全长为 348 bp的 MA18P7重链可变区基因和全长为 321 bp的轻链可变区基因正确地克隆到 pTO-T7载体中, 与 GenBank 所载序列相符, 且符合正确翻译 6个 His的读码框。212  MA18P7抗体可变区片段的表达与纯化重组质粒 pTO-T7-MA18P7-VH 和 pTO-T7-MA18P7-VL 分别转化 E . coli ER2566, 菌体经 IPTG温度诱导后, 15%的 SDS-PAGE显示在 14 kD和 13 kD的位置各有一条特异的表达带 (图 2, lane 3, 6) , 即为MA18P7抗体片段 VH 和 VL。所表达蛋白主要以包902 生   物   工   程   学   报 20卷涵体的形式存在,上清中表达量极低(图中未显示)。VH、VL 包涵体分别溶于含 8molPL 尿素、4 molPL 尿素的Buffer Ñ中(图 2, lane 4, 7)。经His柱纯化后纯度> 90%(图 2, lane 5)。图 1 重组质粒 pTO-T7- MA18P7-VH和 pTO-T7-MA18P7- VLFig. 1  Recombinant plasmids of pTO-T7- MA18P7-VHand pTO-T7-MA18P7- VL图 2 MA18P7 抗体可变区片段的 SDS- PAGEFig. 2 SDS- PAGE of antibody variabledomain fragments of MA18P71: molecular weight marker; 2: bacterial body of E . coli transformed bypTO-T7; 3: bacterial body of E. coli t ransformed by pTO-T7-MA18P7-VH ; 4: recombinant VH in 8molPL urea solution; 5: purif ied VH; 6:bacterial body of E. coli transformed by pTO-T7-MA18P7-VL ; 7:recombinant VL in 4molPL urea solution; 8: purified VL213  生物传感器测定抗体片段的抗原结合活性应用生物传感器检测重组小分子抗体与 pre-S1抗原的结合,可见抗原抗体结合曲线在 VH 或 VL 单独进样后几乎不发生任何变化 (图 3B、C ) , 表明MA18P7单域抗体 VH 和 VL 单独均不具抗原结合活性。而VH 和 VL 复性产物等量混合后的混合物进样后可发现一个迅速的结合过程 (图 3A、D) , 说明MA18P7的轻链可变区抗体片段和重链可变区抗体片段在体外通过非共价键结合在一起, 形成了具有完整抗原结合活性的最小抗体片段 Fv。此外, 把混合物在37 e 温育 4h后的产物(图3A)与VH 和VL 混后即测 (图 3D)比较未见明显差异, 表明抗体片段VH 和VL 通过非共价键结合成 Fv 的过程是在短时间内完成的。图 3 MA18P7 小分子抗体与pre- S1 抗原的结合曲线Fig. 3 Binding curves of small molecular antibodiesof MA18P7 with pre- S1 antigenA:Mixture of VL and VH incubated for 4h on 37 e ;B:VH ; C: VL; D:mixture of VL and VH, no incubation214  ELISA测定小分子抗体的抗原结合活性竞争 ELISA 发现单独 VH 或 V L 均不能竞争抗pre-S1单抗 4D11与抗原的结合,而二者等量混合后形成的Fv段,竞争抑制率达 70%以上(图 4) , 表明单抗 MA18P7的抗原结合活性区域由重链可变区和轻链可变区共同组成。图 4 MA18P7 小分子抗体对单抗4D11 与抗原结合的竞争Fig. 4  Competition of antigenic binding of McAb4D11 by small molecular antibodies of MA18P7以抗 His 抗体为酶标抗体, 间接法 ELISA 检测重组小分子抗体的抗原结合活性, 结果与竞争法一致,单独的重链可变区或轻链可变区片段均无明显抗原结合活性,而混合后形成的 Fv 则能较好的结合抗原(图 5)。图 5 MA18P7 小分子抗体的间接 ELISA结果Fig. 5 Indirect ELISA of recombinant smallmolecular antibodies of MA18P79036 期 管宝全等: 乙型肝炎病毒 pre_S1区中和抗体可变区的原核表达3  讨论抗体活性依赖于其复杂的立体结构和某些化学修饰, 因此除单链抗体外通常难以在原核中获得抗体活性片段。后来人们发现大肠杆菌的质周腔可将蛋白作一定程度的修饰, 使应用细菌表达抗体片段(Fab或 Fv)成为可能。Skerra[10]等采用了先将 Fv片段分泌到大肠杆菌的周质腔后再过亲和层析柱纯化,首次在大肠杆菌中获得了能够保持抗体的抗原结合活性的小分子抗体 Fv。但周质分泌表达通常效率低下,严重抑制工程菌的生长,造成蛋白产量相对较低,很难扩大生产,难以满足对蛋白产量有一定要求的实验需求。本研究采用大肠杆菌原核表达系统,小分子抗体在细胞质中形成不溶的无活性的包涵体, 经过尿素变性与透析复性过程而最终得到活性恢复的可变区抗体片段, 等量的两种可变区抗体片段混合后获得的 Fv 片段较好的保持了亲本单抗的抗原结合活性,成为原核表达获得抗体活性片段的又一途径。不少研究表明 VH 对抗原的结合起主要作用[ 11- 13],不少单抗的VH 本身即可与抗原良好结合,但单独的轻链有时也能够与抗原结合[ 14],甚至有单独的轻链可变区 CDR3片段结合抗原的报道[ 15]。本研究通过对抗体 MA18P7的小分子抗体片段的研究显示,该单抗的VH 和VL 均无法与pre-S1抗原结合,只有二者相互结合形成 Fv 后才能保持亲本抗体MA18P7对特异抗原的结合活性。HBV pre-S1 中的 aa21-47短肽是病毒附着细胞的部位,黑猩猩实验中已证明这一短肽疫苗可诱生出保护性抗体[ 16]。中和抗体 MA18P7 识别 pre-S1aa31-35的 DPAFR 五肽, 可能通过与 HBV pre-S1的结合导致病毒表面蛋白构型的变化, 病毒不能吸附并穿入肝细胞, 从而起到中和作用, 因此具有成为HBV特异性治疗抗体的可能。但由于 MA18P7的鼠源性,应用于临床容易引发异源免疫反应,产生人抗鼠抗体( HAMA) ,影响治疗的效果,甚至引起严重的免疫损伤。本研究通过基因工程的方法, 获得了重链可变区与轻链可变区结合而成的MA18P7的 Fv片段。相对于完整单抗而言, Fv 段仅保留了抗体重链和轻链的可变区,去掉了所有的恒定区,一方面分子量仅为完整抗体的 1P6,大大降低了免疫原性, 减少了HAMA发生的可能, 另一方面由于无 Fc段, 不易与具有Fc受体的非靶细胞结合, 减少了非特异结合的可能,此外小分子 Fv 参与血液循环和全身廓清的速度比全抗体快, 半衰期短, 不易对全身正常组织产生不利的影响。研究中所获得的 Fv 片段具有较高的抗原结合活性,能够与 HBV pre-S1抗原产生较为牢固的特异结合, 有利于其发挥中和作用而达到清除血液中的病毒的目的,在体外疾病诊断、生物传感器、生物分离作用以及抗体的结构功能研究等方面均具有潜在的应用前景。REFERENCES(参考文献)[ 1 ] Gerner PR, Friedt M , Oett inger R et al . 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To express small molecular antibody of MA18P7, the genes of the heavy chain variabledomain ( VH ) and the light chain variable domain (VL ) of MA18P7 were cloned respectively into prokaryotic expression vectorpTO-T7 and expressed in E . coli . Both VH and VL were highly expressed in the form of inclusion body, which could attain over90% pure by a process of denaturalization, renaturation and metal ion affinity chromatography. The results of biosensor,competitive inhibition ELISA and indirect ELISA demonstrated that the VH or VL fragment alone couldn. t combine with HBV pre-S1 antigen, while the pre- S1 antigen and 37e incubated equal molar mixture of VH and VL mixed could bind tightly to form theact ive variable domain Fv with good combining activity. Thus suggested that the antigen- binding region of MA18P7 consist of VHand VL together.Key words  hepatitis B virus, neutralizing antibody, variable domain, expressionReceived: 03-26-2004This work was supported by High Technology and Development Program of China ( / 8630Program, No. 819-Q-06, No. 2001AA628120) .* Corresponding author. Tel : 86-592-2184110; E-mail: zhangj@ jingxian. xmu. edu. cn本 期 广 告 索 引企 业 版 位 企 业 版 位Amersham Biosciences 公司 封底Roche诊断公司 封二美国英杰生命技术公司 封三Promega公司 文前Ñ 、Ò杭州博日科技有限公司 文前Ó 、Ô上海高机生物工程公司 文前Õ、Ö上海苏泊信息技术有限公司 文前×Ø江苏达森集团 文前Ù镇江东方生物工程公司 文前 Ú青岛微生态工程技术研究中心招聘广告 p. 992扬中威柯特公司 文后Ñ南通通联发酵设备公司 文后 Ò赛普膜科技发展有限公司 文后ÓPromega 公司 文后Ô南京宁和生化设备公司 文后Õ北京五洲东方科技发展有限公司 文后Ö9056 期 管宝全等: 乙型肝炎病毒 pre_S1区中和抗体可变区的原核表达

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21252/%e4%b9%99%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92pre-S1%e5%8c%ba%e4%b8%ad%e5%92%8c%e6%8a%97%e4%bd%93%e5%8f%af%e5%8f%98%e5%8c%ba%e7%9a%84%e5%8e%9f%e6%a0%b8%e8%a1%a8%e8%be%be.pdf?sequence=1&isAllowed=y

乙型肝炎病毒pre-S1区中和抗体可变区的原核表达

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