目的 :降低HEV中和性单抗 (mAb) 13D8的鼠源性 ,表达其单链抗体 (scFv)。方法 :从分泌 13D8鼠mAb的杂交瘤细胞中 ,通过RT PCR克隆mAb的VL、VH 基因 ,并进一步组装成VH linker VL 型的scFv片段。将scFv片段克隆到pTO T7载体中 ,在大肠杆菌中进行表达。用ELISA、Westernblot检测scFv的活性。结果 :SDS PAGE表明 ,13D8的scFv在E .coli中得到高效表达 ,表达量达菌体总蛋白的 2 6 .8%左右 ,表达产物主要以包涵体的形式存在。间接ELISA和Westernblot检测表明 ,表达的 13D8的scFv能与HEVOFR2区中一段重组蛋白(NE2 )特异结合。竞争ELISA表明 ,scFv与原鼠mAb识别的为同一表位。结论 :成功地表达出具有免疫学活性的 13D8的scFv

夏宁邵

张军

朱子恒

李利峰

王颖彬

罗文新

顾颖

Xiamen University Institutional Repository

#论著# 文章编号: 1007- 8738( 2004) 05- 0556- 04抗HEV中和抗体 13D8的单链抗体的构建及表达李利峰1, 罗文新1, 2, 顾  颖1, 朱子恒1, 王颖彬1, 张  军1, 夏宁邵1*(厦门大学: 1细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室; 2海洋与环境科学学院, 福建 厦门 361005)收稿日期: 2003- 09- 17;  修回日期: 2003- 10- 27基金项目: 福建省科技重大项目基金资助(No. 2002F013) ; 国家/ 十五0创新药物博士基金资助 ( No. 2003AA2Z3539) ; 福建省自然科学基金资助项目( No.C0310005)作者简介: 李利峰( 1978- ) , 男, 湖南汩罗人, 硕士生.* Corresponding author, Tel: ( 0592)2184110Email: nsxia@ jingxian. xmu. edu. cnConstruction and expression of single-chain antibody of neutralizing monoclon-al antibody 13D8 against hepatitis E virusLI Li-feng1, LUO Wen-xin1, 2, GU Ying1, ZHU Zi-heng1,WANG Ying-bin1, ZHANG Jun1, XIA Ning-shao1*1The Key Laboratory of the Ministry of Education for Cell Biology andTumor Cell Engineering; 2College of Oceanography and EnvironmentalSciences, Xiamen University, Xiamen 361005, ChinaAbstractAIM: To weaken the immunogenicity of the neutralizing mono-clonal antibody ( mAb) 13D8 against hepatitis E virus and ex-press its scFv. METHODS: The VL and VH genes were clonedby RT-PCR from hybridoma cells producing mouse mAb. Andthen VH-linke-r VL fragment ( scFv) was constructed and clonedinto vector pTO-T7. The scFv proteinwas expressed in E . coli.The activity of expressed scFv was detected by ELISA andWestern blot. RESULTS: SDS-PAGE analysis showed that thescFv was highly expressed mostly in the form of inclusion bodyin E . coli, and the yield was up to 26. 8% of the total bacteriaprotein. The results of indirect ELISA and Western blot showedthat the expressed scFv could bind specifically to a recombinantprotein in OFR2 region of HEV ( NE2) . The result of competitiveELISA demonstrated that the epitope recognized by the scFvwas the same as that by mAb 13D8. CONCLUSION: The scFvconstructed from VH and VL genes of mAb 13D8 with immunolog-ical activity was successfully expressed.Keywords: HEV; single-chain antibody; prokaryotic expression摘要目的: 降低 HEV中和性单抗( mAb) 13D8 的鼠源性, 表达其单链抗体( scFv)。方法: 从分泌 13D8 鼠 mAb 的杂交瘤细胞中,通过 RT-PCR 克隆mAb 的 VL、VH 基因, 并进一步组装成 VH-linker-VL 型的 scFv片段。将 scFv片段克隆到 pTO-T7 载体中,在大肠杆菌中进行表达。用 ELISA、Western blot 检测 scFv 的活性。结果: SDS-PAGE 表明, 13D8 的 scFv 在 E. coli 中得到高效表达, 表达量达菌体总蛋白的 26. 8%左右, 表达产物主要以包涵体的形式存在。间接 ELISA 和 Western blot 检测表明, 表达的 13D8 的 scFv 能与 HEV OFR2 区中一段重组蛋白( NE2)特异结合。竞争 ELISA 表明, scFv 与原鼠 mAb 识别的为同一表位。结论: 成功地表达出具有免疫学活性的 13D8的scFv。关键词: HEV; 单链抗体; 原核表达中图分类号: Q786   文献标识码: A  戊型肝炎是由戊型肝炎病毒( HEV)引起的一种胃肠道传播的急性肝炎, 主要流行于亚洲、非洲和中美洲发展中国家, 是一种世界性的危害严重的传染病[ 1]。近年来, 陆续在猪、鼠和鸡等与人类关系密切的动物中发现HEV 的感染, 使人们对于戊肝的重要性又有了新的认识[ 2]。HEV基因组含 3个开放读码框架(ORF) , 其中 ORF2编码病毒结构蛋白, 组成病毒衣壳。本课题组表达了 HEV ORF2区中一段重组蛋白 NE2, 证明NE2蛋白可较好地模拟 HEV病毒衣壳蛋白的天然立体结构, 并正确形成重要的中和表位[ 3-6]。我们在此基础上, 用NE2蛋白免疫小鼠制备出 3株具有中和活性的单克隆抗体(mAb) , 其中 mAb13D8与 8C11可识别HEV ORF2上的同一个构象型中和表位区域[ 7, 8]。本实验在 13D8杂交瘤细胞的基础上, 研制出其单链抗体( scFv) , 该抗体能与 NE2特异结合, 与原鼠 mAb识别的为同一表位, 为HEV 感染机制的研究、戊肝的抗体治疗研究奠定了基础。1  材料和方法1. 1  材料  可分泌抗 HEV mAb 13D8的鼠杂交瘤细胞系, 由本实验室制备。大肠杆菌菌株 DH5A、ER2566由本室保存。pTO-T7由本室构建[ 9]。pMD18-T载体、各种限制酶及T4 DNA ligase均购自大连Takara公司。Trizol 购自 Roche 公司。Oligo ( dT)、AMV 及556 ISSN1007- 8738 细胞与分子免疫学杂志( Chin J Cell Mol Immunol) 2004, 20( 5)Rnasin购自Promega公司。PCR回收试剂盒购自上海华舜公司。NE2 抗原由本室表达纯化。HEV-IgG的ELISA试剂盒购自北京万泰生物药业有限公司。所用引物均由上海博亚公司合成(见表 1)。表 1 PCR引物的名称和序列Tab 1 Names and sequences of PCR primers Name of primer           Sequence MKCR1 5c-TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCCTGT TGA A-3c MuIgk VL 5c-G3 5c-ATG GT( C/T) CT(C/T) AT( A/ C/G) TT( A/ G) CTG CTG CTA TGG-3c MuIgG VH 5c- C2 5c-CGA CAT GG( A/ C/G) TTG G( C/G)T GTG GA(A/ C) CTT GC( C/ T) ATT CCT-3c MuIgG VH 3c- 2 5c-CCC AAG CTT CCA GGG (A/G) CC A(A/G) (G/T) GGA TA(A/G) AC(A/ G/ C/T) G( A/ G) T GG- 3c 13D8HF1 5c-GAA TTC GAT GTA CAA CTT CAG G-3c 13D8HR1 5c-GCT ACC ACC CCC TCC AGA TCC GCC ACC TCCTGA AGA TAC GGT GAC CGT GGT GCC-3c 13D8KF1 5c-A TCT GGA GGG GGT GGT AGC GGT GGA GGC GGG AGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG-3c 13D8KR1 5c-GTC GAC CCG TTT GAT TTC CAG C-3c1. 2  方法1. 2. 1  抗体可变区基因的分离  半贴壁培养 107 个13D8鼠源杂交瘤细胞, 用Trizol法提取总RNA, 并以poly( T)为引物反转录成 cDNA。采用 PCR法分离抗体可变区基因; 使用根据 Novagen公司的 Ig-Prime kit合成的引物, 以及另外设计合成的 1 条下游引物MKCR1进行扩增, 结果用MuIgk VL 5c-G3/ MKCR1引物对经以下条件扩增, 获得 1条单一的约 700 bp的DNA片段。PCR条件为: 94 e 5min, 94 e 40 s, 53 e1 min, 72 e 50 s, 共 35 个循环, 再于 72 e 延伸 15min。回收 PCR 产物并克隆至 pMD 18-T 载体中, 送上海博亚公司测序, 序列在 NCBI 网 ( http: / / blast.ncbi. nih. gov)经 Blast比对后, 确定为 mAb 13D8完整轻链序列。用 MuIgG VH 5c-C2/ MuIgG VH 3c-2 引物对, 在以下条件扩增, 获得 1条单一的约 400 bp 的DNA片段。PCR条件为: 94 e 5min, 94 e 40 s, 53 e1 min, 72 e 40 s, 共 35 个循环, 再于 72 e 延伸 15min。回收 PCR 产物并克隆至 pMD 18-T 载体中, 送上海博亚公司测序, 序列经 blast比对后确定为 mAb13D8的 VH基因序列。1. 2. 2  scFv 表达载体的构建  以 13D8HF1/13D8HR1为引物对, 可扩增出 13D8的VH基因片段,以13D8KF1/ 13D8KR1 为引物对, 可扩增出 13D8 的VL基因片段。分别回收两个片段, 再以这两个片段互为引物及模板, 在新的 PCR系统中进行重叠延伸,得到少量完整的 scFv基因片段。然后以完整片段为模板, 以 13D8HF1/ 13D8KR1 为引物进行大量扩增。将回收的 scFv 基因片段经 EcoR I/ Sal I双酶切, 克隆到pTO-T7原核表达载体中, 得到表达质粒 pT-D8-scFv。1. 2. 3  scFv在大肠杆菌中的表达及初步纯化  以得到的重组质粒 pT-D8-scFv 转化 ER2566 大肠杆菌菌株, 挑取单菌落于 500 mL LB(含 Kan 100 mg/ L )培养基中, 于 37 e 振荡培养过夜。菌液的 A 600值达 0. 8左右, 以 0. 2 mmol/L 的 IPTG诱导。在 30 e 表达 6 h后收获菌体, 超声破碎, 以 15 000 r/ min离心10 min,取沉淀溶于与上清等体积的 20 mmol/ L Tris-HCl ( pH7. 6)中。取等量上清和沉淀溶液进行 SDS-PAGE。堆积胶的浓度为 5% , 分离胶浓度为 12%。超声沉淀用 20 mL/ L Triton X-100洗涤两次后, 溶解于 8 mol/ L尿素中。将 8 mol/ L 尿素中的蛋白稀释到 50 mg/ L,加入 100 mmol/ L 的巯基乙醇轻微振荡5 h, 逐步对pH 8. 0 的 PBS透析后, 以 12 000 r/ min 离心 10 min去除沉淀, 最终即得到 scFv的初纯品。1. 2. 4  scFv活性的间接 ELISA法检测  将以上单链抗体的初纯品进行倍比稀释后, 各取 100 LL 加入已包被NE2的96孔板中, 37 e 孵育 1 h。加入1B2 500稀释的HRP标记抗 6 His抗体 100 LL, 于 37 e 孵育 30min, 显色 15 min并终止反应后, 测定 A 450/ 620的值。1. 2. 5  scFv活性的Western blot检测  将纯化的NE2进行常规 SDS-PAGE, 并电转移至硝酸纤维素膜上,以浓缩 20倍的初步纯化的 scFv 与之反应, 以 HRP标记的鼠抗His标签抗体为二抗进行显色。1. 2. 6  scFv 抗原特异性的竞争 ELISA 法检测  以97. 5 Lg/ L 的 NE2 抗原包被酶标板。每孔各加入50 LL 倍比稀释的13D8的 scFv, 各孔再加入50 LL 1B500稀释的 HRP 标记鼠 mAb 13D8。并分别以原鼠mAb 13D8及 PBS为阳性及阴性对照, 混匀后于 37 e孵育 1 h, 显色 15 min, 反应终止后测定 A 450/ 620值,并按下列公式计算其竞争抑制率。竞争抑制率( % )= ( mAb 13D8- HRP A 450/ 620- 13D8的 scFv A 450/ 620 ) /( mAb 13D8- HRP A 450/ 620) @ 100%。2  结果2. 1  mAb 13D8 V区基因的分离  根据 Novagen 公司的 Ig-Prime kit, 合成了 15条VH基因特异的简并上557ISSN1007- 8738 细胞与分子免疫学杂志( Chin J Cell Mol Immunol) 2004, 20( 5)游引物, 16条VL基因特异的简并上游引物, 3条 CH基因特异的简并下游引物及 2条 CL基因特异的下游引物。采用PCR法, 分离mAb的 V区基因, 结果获得编码 mAb 13D8 基因可变区的核苷酸序列。mAb13D8的 VH 和VL基因分别长 351和 324 bp, 分别编码117个和 108个氨基酸(图 1)。GAT CTA CAA CTT CAG GAG TCA GGA CCT GGC CTC GTG AAA CCT TCT CAG TCT CTG TCT CTC 60Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu 20TCC TGC TCT GTC ACT GGC TAC TCC ATC ACC AGT GGT TAT TAC TGG AAC TGG ATC CGG CAG120Ser Cys Ser Val Thr Cly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln 40TTT CCA GGA AAC AAA CTG GAA TGG ATG GGC TAC ATA GGCTAC GAC GGT AGC AAT AAG TAC180Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr 60AAC CCA TCT CTC AAA AAT CGA ATC TCC ATC ACT CGT GACACA TCT AAG AAC CAG TTT TTC240Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser lle Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 80CTG AAGTTG ACT TCT GTG ACT ACT GGG GAC ACA GCT ACA TAT TAC TGT GTA AGA GAT GTT300Leu Lys Leu Thr Ser Va l Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Val 100AAGTAC TAC TTT GAC TAC TGG GGT CAA GGC ACC ACG GTC ACC GTA TCT TCA GGA GGT GGC360Lys Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 120GGA TCT GGA GGG GGT GGT AGCGGT GGA GGC GGG AGT GACATC CAG ATG ACT CAG TCT CCA420Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln M et Thr Gln Ser Pro 140GCC TCC CTA TCT GTA TCT GTG GGA GAA ACT GTC ACC ATC ACA TGT CGA GCA AGT GAG AAT480Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn 160ATT TAC AGT AAT TTA GCA TGG TAT CAG CAG AAA CAG GGA AAA TCT CCT CAG CTC CTG GTC540Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 180TAT GCT GCA ACA AAC TTA GCA GAT GGT GTG CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGC600Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 200ACA CAG TAT TCC CTC AAG ATC AGCAGC CTG CAG TCT GAA GAT TTT GGG AGT TAT TAC TGT660Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys 220CAA CAT TTT TGG GGT TCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGCACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG720Gln His Phe Trp Gly Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 240图1  来自 mAb 13D8 基因的 scFv DNA 核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig 1  Nucleotide and deduced amino acid sequences of scFv DNAfrom mAb 13D8 geneNote: Italics stand for l inker.2. 2  scFv基因表达载体的构建  将 mAb 13D8的 VH和VL 基因通过 ( GGGGS) 3短肽连接成 scFv DNA 片段。经 EcoR I/ Sal I 双酶切后, 克隆到 pTO-T7原核表达载体中, 得到表达质粒 pT-D8-scFv(图 2)。此载体表达出的 scFv即带有 6个His的标签。图 2 pT-D8-scFv 质粒的构建Fig 2 Constructed plasmid pT-D8-scFv2. 3  scFv基因在大肠杆菌中的表达  以重组质粒pT-D8-scFv转化大肠杆菌ER2566菌株表达mAb 13D8的 scFv。SDS-PAGE结果表明, 在 M r 约 32 000处有表达条 带, 表达 的 scFv 占 菌体 总蛋白 量 的26. 8%左右, 且主要以不溶性的包涵体形式存在, 溶解于 8 mol/ L 尿素中(图 3)。图 3  13D8 的 scFv在大肠杆菌中的表达的 SDS-PAGEFig 3 Analysis of the expression of scFv in E. coli by SDS-PAGEM: Protein marker; 1: Lysate of E . coli ER2566 expressing scFv; 2: Super-sonic supernatant ; 3: Supersonic precipitate; 4: scFv in 8 mol/L urea; 5:scFv after dialysis.2. 4  scFv与 NE2抗原结合活性的 ELISA测定  将溶于8 mol/ L 尿素中的 scFv蛋白透析复性后, 最终得到 scFv 的初纯品(图 3)。间接 ELISA检测结果表明,scFv 在 1B1稀释时的 A 450/ 620值为 2. 04 ? 0. 01, 1B8稀释时为 0. 30 ? 0. 02, 而且随着 scFv 浓度的下降,A 450/ 620值逐渐降低, 说明表达的 scFv 能与 NE2抗原特异性结合。2. 5  scFv与 NE2抗原结合活性的 Western blot测定 将纯化的 NE2抗原进行 SDS-PAGE, 并电转移至硝酸纤维素膜上, 滴加初步纯化并浓缩 20倍的 scFv 与之反应, 再以HRP 标记的鼠抗His tag抗体作为二抗进行显色。结果在 M r 为 50 000左右处出现显色条带, 表明 scFv可特异性地与NE2起反应(图4)。图 4  scFv与 NE2结合的Western blot分析Fig 4 Analysis of the binding of scFv to NE2 by Western blotM: Protein marker; 1: React ive band for binding of scFv to NE2.2. 6  scFv的抗原特异性检测  采用竞争 ELISA法检测初步纯化出的 scFv 的抗原结合特异性。当将HRP标记mAb 13D8的浓度固定为 1B500 时, 其与 scFv 混558 ISSN1007- 8738 细胞与分子免疫学杂志( Chin J Cell Mol Immunol) 2004, 20( 5)合反应的 A 450/ 620值随着 scFv 浓度的减少而逐步增大。当 scFv做 1B1稀释时, 竞争抑制率达到 72. 95%,表明表达的 scFv 与原 mAb 13D8结合的为同一抗原表位, 二者具有相同的抗原结合特异性。3  讨论病毒性疾病的预防主要以病毒疫苗为主, 治疗上除特异性的抗病毒抗体外, 尚无其他特异性的治疗药物。本实验室制备的鼠 mAb 13D8 与 mAb 8C11识别同一构象型表位, 都是HEV 的中和抗体, 具有中和和阻断病毒感染的功能, 为潜在的 HEV治疗性抗体药物。但异源抗体对于人体具有免疫原性, 会引起强烈的抗抗体免疫反应。scFv 含有完整抗原结合位点, 但其具有 M r小、免疫原性低和穿透力强等优点, 作为一种治疗制剂应用于临床优于完整抗体。本研究中, 我们从分泌 mAb 13D8的杂交瘤细胞中获得其 VL、VH 基因序列, 组装成 VH- linker-VL 型的 scFv后, 在大肠杆菌中获得了高效表达(表达量达菌体总蛋白的 26. 8%左右)。但与多数 scFv 一样,该 scFv的表达主要以包涵体的形式存在。以这种形式表达的 scFv虽产量高、速度快、成本低, 并可避免表达产物在细胞内降解, 但须经复性才能恢复其活性。现已有不少良好复性的方法[ 10-12] , 其中将包涵体经 8 mol/L 尿素变性和稀释透析复性后, 可得到具有免疫学活性的 scFv。我们用间接 ELISA和Westernblot分析表明, 复性的 scFv 能很好地与 NE2抗原特异结合, 并表明其与原 mAb 13D8识别同一表位。目前, 基因工程抗体有细菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞 4个表达系统, 各有利弊。且不同的抗体在同一系统或同一抗体在不同系统的表达都会有所差异, 没有一个通用的表达模式[ 13]。我们将在本研究的基础上, 继续探索 scFv 在其他表达系统中的表达, 通过寻找最佳的表达方式, 获得最高水平、最佳活性的表达, 为将其作为戊肝的诊断试剂和治疗性抗体药物提供可能性。参考文献:[ 1] Wang YZ, Li H, Gu Z, et al . 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抗HEV中和抗体13D8的单链抗体的构建及表达

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21251/%e6%8a%97HEV%e4%b8%ad%e5%92%8c%e6%8a%97%e4%bd%9313D8%e7%9a%84%e5%8d%95%e9%93%be%e6%8a%97%e4%bd%93%e7%9a%84%e6%9e%84%e5%bb%ba%e5%8f%8a%e8%a1%a8%e8%be%be.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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