首次在汞膜电极上利用循环伏安、微分脉冲和交流伏安法研究脱氧核糖核酸（ＤＮＡ） 的电化学行为。结果表明汞膜电极作为一类固体电极可应用于负电位区ＤＮＡ电化学行为的 研究。同时结合凝胶电泳和ＵＶ光谱法，研究了用纯高氯酸处理的ＤＮＡ的氧化还原特性，结 果表明纯高氯酸可引起ＤＮＡ的变性和降解。纯高氯酸不适宜用于ＤＮＡ的变性处理

吴金添

周剑章

林仲华

罗瑾

黄寅

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第 26 卷1卯 8 年 7 月分析化学 (FENXI HU AX UE ) 研究简报Chi ne se Jo 切旧al of 为过州c过 Che而s甸第 7 期819 ~ 82扩汁朴汁汁洲镖.柔.戛.洲.气报 本.汁建脱氧核糖核酸在汞膜电极上的电化学行为吴金添 周剑章 黄 寅 罗 瑾 林仲华’(厦 门大学化学系,固体表面物理化学国家重点实验室,物理化学研究所,厦 门 361 田5 )摘 要 首次在汞膜电极上利用循环伏安、微分脉冲和交流伏安法研究脱氧核糖核酸(DNA )的电化学行为。结果表明汞膜电极作为一类固体电极可应用于负电位区 D NA 电化学行为的研究。同时结合凝胶电泳和 U’V 光谱法,研究了用纯高氯酸处理的 D NA 的氧化还原特性,结果表明纯高氯酸可引起 D NA 的变性和降解。纯高氯酸不适宜用于 D NA 的变性处理。关键词 脱氧核糖核酸,汞膜电极,高抓酸1 引 言D NA 的电化学行为具有重要的理论与实际意义。目前它的氧化是利用碳、金等固体电极在比较正的电位进行,其还原是利用滴汞电极(D ME )或悬汞电极(H M D E )一类的液态汞电极在相当负的电位进行〔’一 6 〕。 作为 DNA 电化学传感器,均采用 的是固体电极以s〕。 若要利用 D NA还原作为电化学传感器的信号或在分子水平上研究其还原过程,那么较难采用液态汞电极。因此寻找一种合适的固体电极以便在负电位区研究 DN A 的还原行为仍是一个巫待解决的问题。本文以银基汞膜电极(SB MFE )代替一般的滴汞电极 (D ME) 或悬汞电极 (H MD E ),研究 DNA在负电位区的电化学行为以l0]。2 实验部分2.1 仪器与试剂电化学测试使用美国 EG &PAR C M27 3 恒电位仪和 Med el 27 0 电化学分析软件。IJV 光谱使用 日本岛津 UV~24 0 分光光度计测量。电解池采用三电极体系,汞膜电极为工作电极,铂丝为辅助电极,饱和甘汞电极(SCE )为参比电极。实验测得的电位均相对于饱和甘汞电极。所有实验都在室温完成。实验时通 凡 除 q。小牛胸腺 DN A (A溯 /A ,= 1.86) 为华美(Hu~ )生物工程公司产品,使用时没有进一步纯化。其他试剂均为分析纯。溶液用二次蒸馏水配制。用甲酸铁调节所使用的Mc ILvai n e 缓冲液(5 5.4 g/ L N处川刃月 + 4.7 9 留L 柠檬酸 + 3.5 9 留L N氏 F) pH= 6.8。2. 2 DN A 变性处理DNA 按下列步骤进行热变性处理:先将 DNA 加热到 10 ℃约 巧 而n ,然后迅速地在冰浴中冷却。D N A 按下列步骤用纯高氯酸处理〔”〕:首先准确称取约 7,s mg 样品,用 l mL 高氯酸处理巧 而n ,然后用 l mL 的 9 mo l/L 的 Nao H 溶液中和,溶液随后滴加 23 ml. 的适当的缓冲溶液至最后体积为 25 mL。2.3 汞膜电极的制备1卯7-07 一 收稿 ;1 卯8一 ro 接受。本文系国家教委和国家自然科学基金资助课题。8 2 0 分析 化 学 第 26 卷选用银丝(纯度 9.9 %,巾30 ~,the Brit sh D rU g H 6use 产品)作为汞膜电极的基体。在未加搅拌的 0.1 o UL 珑(N03),(pH二2) 溶液中,电位控制在 0.2 v 电沉积汞。为了改进它的电化学性能,可将汞膜电极在 1.0 mo UL Na 0 H 溶液中控制电位在一 2.5 V 下极化几秒钟进行预处理。另外,我们发现在已老化的汞膜电极上电沉积汞,这样制备的汞膜电极具有较好的性能。因此,在我们的实验中,使用的都是经过二次或者二次以上电沉积后的汞膜电极。汞膜电极存放在蒸馏水 中,在老化的汞膜电极上电沉积 1 脚 厚汞层的银基汞膜 电极(SBMFE ),可持续使用 4 8 h。3 结果与讨论3.1 汞膜电极上 D NA 在负电位区的电化学行为天然 DNA 和热变性 D NA 的还原的微分脉冲伏安图示于图 1。由图可见,在实验扫描电位范围内,天然 DNA 没有给出任何信号,热变性 D NA 在一 1’.4 V 附近较易在 SBMFE 上还原。热变性 D NA经第一个循环还原后,从第二个循环开始没有给出伏安信号,说明强吸附在电极表面的变性 DNA 还原产物抑制了 DNA 的进一步还原。DNA 的 4 种核昔的微分脉冲伏安图示于图 2。很明显,热变性 DNA 的还原峰对应于腺嗦吟(A )和胞喃吮 (C) 残基的还原,这与利用DME 和 HMD E 测得的结果是一致的〔‘一“〕。交流实验(交流伏安和交流阻抗)没有给出 DNA (天然和变性 )在电极表面上吸附的迹象。D NA 在汞膜电极上难于吸附,这一行为与滴汞电极上的吸附大为不同,文献上报道〔’.2 5,6 〕,只要将 HMD E 插人含有 D NA的溶液中,DN A 便吸附在 H MD E 表面,这反映液汞电极和汞膜 电极之间的差别。DM E或 HMD E 表面较易变形,而作为固态电极的SBMFE 的表面汞层比较刚性,因此在液汞电极上的 DNA 链与电极表面会有比较多的接触,有利于 DNA 分子在液汞电极表面的吸附。3.2 用纯高氮酸处理 D NA有许多方法可 以引起 D NA 的变性,例如:热变性,酸变性等。Bre tt等使用了高氯酸变性 DNA 并研究了其在玻碳电极上的氧化行为〔‘,〕。 他们和我们的实验结果表明,除了用高氯酸处理的 D NA 氧化时电流比较大外,两者的氧化行为差别不大。这里,我们比较详细地研究了用纯高氯乏”·0 6一e.2 一 0.4 一 0.6 一 0 8 一 卜 0 一 1.2 一 1.4 一 1.6E IV图 ‘ 天然和热变性 ,J}牛胸腺 DNA 的还原的微分脉冲伏安图Fi g.1 压fe 此n tid p己se v oltamn犯g 冠m of na tive 山记 de-朋汕司c迸 山押此 d的xyri场n u e le ic 朗id(DN A )(a) 变性 DNA 的第一循环(the 6成 叮de of 山泪助四日 DN A at。姗卿加石二 J 期n官L) ; (b) 变性 DNA 的第二循环 (the 。-耐 叮Cle J (a)); (c)天然 (袖ve )DNA (at 。阴C即切‘二 ‘3侧) n官L)。Mc l俪ne 缓冲溶液(玩进沙)(b 曲线与 C重合 )(~b i。~。 . 口e e )。酸处理的 D NA 的性质,发现了一些不寻常的现象。3.2.1 非电化学方法 当 DNA 用高氯酸处理到足够长的时间,产生一种褐色的沉淀物。用高氯酸处理胸昔时发现同样颜色的沉淀物,腺昔、胞昔和鸟昔没有这一现象。用凝胶电泳检测DNA 的分子量,发现热变性 DNA 和天然 D NA 有一窄的泳带。在 260 nm 波长,U’V 光谱吸收顺第 7 期 吴金添等:脱氧核糖核酸在汞膜电极上的电化学行为 8 2 1序如下:用高氯酸处理的 DN A> 热变性 DNA> 天然的 D NA。这些结果表明 DNA 链被高氯酸降解成小分子,D NA 中的碱基对间的氢键遭到比热变性 DNA 更多的破坏,导致电泳实验澳乙锭(EB) 无法显示和 IJV 吸收光谱的增色效应。3.2.2 电化学方法 用纯高氯酸处理的 DNA 的循环伏安图示 于 图 3。与热变性 D NA 和天然DN A 不同,伏安图上 A、C 还原峰消失了,而在电位一 o.S V 和一 l.l v 附近出现二对附加的氧化还原峰 (实验 已证实它不是高氯酸的氧化还原峰)。这可能因 DNA 中 A、C残基被高氯酸破坏的产物给出伏安峰,并且该氧化还原反应具有某种程度的可逆性。更有趣的是我们发现用高氯酸处理的 DNA 很容易吸附在电极表面上,仅仅把电极插人含有高氯酸处理的 DN A 溶液中吸附便发生了,这 一特 征 易用 吸 附转 移 溶 出伏 安 法(A山rs v )检测到t51。我们还发现用高氯酸处理的D N A 能影响氢在 SBMFE 上的析出反应,大量氢析一 0.2 一 0.4 一 0 一 0.8 一 1E IV竿一 1.2 一 l图 2 DN A 的 4 种核昔的微分伏安图Fis.2 压瓜ren ti以 p过se v o l加灿叫gn 训 of fo ur nu-司~idesa.腺昔 (目即佣ine ) ; b.胞昔 (cyti di ne ); 。.鸟 昔(, ~ine ); d.胸昔(th洲山n e)。浓度 (~ 即七西 . ):o.1 .n 闹IL,扫描速度(~ 毗): lo mv /, ,磷酸缓冲溶液(pb呷卜‘e b曲油 刻u tion )。出之前在一 1.S V 附近出现了一个相当大的电流峰(图 4 )。因为电流如此大,不可能是 DN A<冬一 0.2 一 0.4 一 0.6 一 0.8 一 1.0 一 1.2 一 1.4 一 1.6E / V图 3 在银基汞膜电极上用纯高氯酸处理的 DNA的循环伏安图Fi g.3 Con v en t10 .过 叮c lie v ol tamn刃g 忿m of D NA仃巴以曰 勿 p切叩 H口q atsave r base me 二uxy filJll elec-切妇e浓度 (咖。三n t面腼): 3 0 呵L; 扫描速度 (~ 毗 ): 1田m v ls ;磷酸缓冲溶液(户呷恤e b团re 汕ti二 )。一 0.2 一 0.4 一 0.6 一 0.8 一 1.0 一 1.2 一 1.4 一 1.6一 1.8 一 2.0E z V图 4 用纯高氯酸处理的 DNA 的循环伏安图(析氢)Fi g.4 伪n ve n ti o 和叭 cyeli e vo ltan ur 州gr anl of DNAtre a ted 坊 p切 re HCl q, sh丽现 the ca园yt ic hy面哪nev Ol uti on in Phos Pha te b以企r降解产物本身的反应峰,我们认为它也是析氢峰。该析氢机理可能是吸附的 DNA 降解产物中的碱基与 H十形成加合物,该加合物中的 H十较易还原成氢分子。这二个结果进一步表明,高氯酸使 DNA 发生降解等变化,处理后产物分子比较小,比 DNA 分子容易在 sB M几上吸附〔‘2〕。82 分 析 化 学 第 26 卷4 结 论实验结果表明:(l) 汞膜电极作为一类固体电极可应用于负电位区 DN A 电化学行为的研究 ; (2) DNA 在汞膜电极上的阴极还原行为与液态汞电极相同,但一D NA 难于在汞膜电极上吸附 ; (3) 尽管在碳电极上经纯高氯酸变性和热变性的 DNA 有类似的阳极氧化行为,但在汞膜电极上,经纯高氛酸变性的 DN A 的 A、C还原峰消失,而在比 A、C还原峰较正的电位出现二对氧化还原峰,说明纯高氯酸处理引起 D NA 变性、降解,且 A、C 残基被破坏成其他小分子,DNA 降解产物易吸附在汞膜电极上,并对析氢有催化作用。致 谢 本课题电泳实验在厦门大学生物系细胞生物学研究室完成,并承蒙陈元霖副教授和桂慕兰实验师的亲切指导和大力协作,谨此表示诚挚的谢意。参 考 文 献1 Palec ek E.刀液肠droc 触饥.Bi oe ne rg. ,1兜1,8: 46 9Z D 口h帅t G.服以溉阮洲店忿叮 of B沁城乒以 加肠肠c山冶.儿脚曲而c Pres,1少刀: Cha P.53 B汕ec e k E.刀汉肠巾次人派.刀艺配脱吧. ,】引肠,巧: 2754 P司ec k E.B众吧le以roc 触饥.刀众地矛姗苔. ,】引扣,20 :l 79S P目ec k E.刀反昭肠d 六把阮m.BI Oe 能咭‘ ,】望拉,28: 7 16 Be 飞 H·in Co 呷陀脸ns 俪 厂陀以诉 of E趾d 欢he 汕忿尽.甜.妙 Sri~S,C址匆旧吐山e v Y A,伪n栩粉 B E,B父妨s J口M,介哪r E.V o l.10,P脆n um P沈S8,】男朽 : 2仍7 Milan K M.珑地目望n S R.A 了心.口妇介. ,】望灯,65:23 17S R目ec e k E,J七len F,Te ije 而 C,Fu c ik V,Jo ri n T M.A耐.Ch 诫.Acta. ,1臾乃,27 3: 1759 予阅hi ds 2.及山.口必几.及理.JPn. ,1蛤1,54: 56210 Stojek Z,K ub lik Z.J.及配￡阴瓜以.以翻砚. ,1鱿陈,印:M gn B找叙 M A C,B肥t A M O.J.召肠以阳。巾以.0 公爪. ,1兜玛,36: 22512 )画k B,Eh ing P J.C触m.双即. ,1失祖,68:四5El ec tr oc he n dcal Beha, 月o rs of 肠。乃的加n u c leic A d dat Mer c川甲 Fili n E lec tr o dsWu Ji nti an,乃以、Ji 歇司诩唱,H l倒ng YIll,加。 Jin,U n 刀加砂ua(&‘e 鞠产肠6Orato 叮for 外”ic 以 O钻功. ‘仃 of 拟记 5啊向邓,加公ute of Ph 少, 交以 以忍功众try,爪~n Un 沁。itx,DeP 阴万众姗几G邝切心时 of 日晚ha 勺36 1(X) 5 )川加坛舰t DNA was stu di ed 场~of cyc lic vol ta叮mle坷 (CV) wi thame 。叼 6linelec tn 记e(MFE )us ingc~tion al CV,d ife 沈n ti吐 p吐se vo l“比田” e try an d al ter 坦血g~t vol ta n u 刀吧tiy.仆e MFE issu fic ie n dy s切山le an d can be u 傲月 to stu 勿e lec t双祀hel 拍e叭悦h~of DN A in then eg a tlve pote n ti以 re-gi on.Th is~th at M几 15 rea dy to beo ne ki nd of sol id el ec t攻刁e at wh ic h o reu se fu l elec 掀he而以te c俪qU es can bee a川ed ou t,su ch as spe c tlx 祀lec t代犯he ln ic al te ehn iqU es.凡记以 ch ~ ter ofDNA 切纽t-ed 场 Pu re H CIO. wasstud ied at M几.h~th at PUre HCl q ~ ld not ouly brin g al ”u t th e d e n atu 卜a tlo n of D NA but the de脚da tio n of it,几花 HC IO. 15 not su i切七le for 拌IfO 耐ng the de n a抚田吐 io n ofD NA.K 月阳阳n 如 D io 芍叨加n u ele ie ac id,meru ry fi lnelec tn 月e , pe re 扭o ri e ac id(凡枕计司 2 」川y l卯 , ; 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脱氧核糖核酸在汞膜电极上的电化学行为

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