目的构建高表达的抗CD5单链抗体(scFv anti-CD5)工程菌,为开展以抗CD5单链抗体为构件的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。方法从Genbank中获得抗CD5单克隆抗体H65的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因序列,用连接肽的编码序列连接,用重叠PCR技术获得目的基因,酶切后插入pET22b(+)构成重组质粒。测序正确的重组质粒转入E.coliBL21(DE3)诱导表达,产物经Ni-NTA柱纯化后复性,流式细胞术和Western blot-ting检测活性。结果获得序列正确的重组质粒,工程菌表达量高,产物复性后具有识别CD5抗原的活性。结论成功构建了高表达scFv anti-CD5的工程菌,为scFv anti-CD5的应用奠定了基础

林晓思

王生育

许健

颜江华

Xiamen University Institutional Repository

抗 CD5 单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定林晓思，许 健，王生育，颜江华( 厦门大学医学院 抗癌研究中心，福建 厦门 361000)摘 要:目的 构建高表达的抗 CD5 单链抗体( scFv anti-CD5) 工程菌，为开展以抗 CD5 单链抗体为构件的肿瘤免疫治疗研究奠定基础。方法 从 Genbank 中获得抗 CD5 单克隆抗体 H65 的重链可变区( VH) 和轻链可变区( VL)的基因序列，用连接肽的编码序列连接，用重叠 PCR 技术获得目的基因，酶切后插入 pET22b( + ) 构成重组质粒。测序正确的重组质粒转入 E． coli BL21( DE3) 诱导表达，产物经 Ni-NTA 柱纯化后复性，流式细胞术和 Western blot-ting 检测活性。结果 获得序列正确的重组质粒，工程菌表达量高，产物复性后具有识别 CD5 抗原的活性。结论成功构建了高表达 scFv anti-CD5 的工程菌，为 scFv anti-CD5 的应用奠定了基础。关键词: CD5; 单链抗体; 基因; 表达中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1005-1678(2011)04-0261-04Gene construction，protein purification and activity evaluation of scFv anti-CD5LIN Xiao-si，XU Jian，WANG Sheng-yu，YAN Jiang-hua( Cancer Research Center，Xiamen University，Xiamen 361000，China)Abstract: Purpose To construct a genetic engineering E． coli strain with high expression level ofscFv anti-CD5 and to lay the foundation for tumor immunotherapy using scFv anti-CD5 as a component．Methods VH and VL fragment of H65 ( an anti-CD5 mAb) is acquired from Genbank，and then joinedwith a linker coding sequence，and the gene via overlapping PCR is constructed． The gene is digested andinserted into pET22b( + ) to form a recombinant plasmid． The E． coli BL21( DE3) bear the plasmid withright sequence is induced with IPTG and the product is purified with Ni-NTA column，renatured，and sub-jected to activity analysis via FCM and Western blotting． Results The recombinant plasmid and the engi-neering E． coli strain with high expression level of scFv anti-CD5 were acquired． The expression productswere able to recognize CD5 antigen after being renatured． Conclusion The acquisition of engineering E． colistrain with high expression level of scFv anti-CD5 would contribute to further application of scFv anti-CD5．Key words: CD5; scFv; gene; expression收稿日期: 2010-03-01基金项目: 国家自然科学基金( 30973485 ) ; 福建省科技厅基金( 2009R10020-1)作者简介: 林晓思，男，硕士研究生，主要从事生化制药研究，E-mail: linxiaosi@ yahoo． com． cn; 颜江华，男，通信作者，教授，博士，Tel: 0592-2180587，E-mail: jhyan@ xmu． edu． cn。双特异抗体可以有效的将效应细胞富集到靶细胞周围，增强对靶细胞的杀伤，因而双特异抗体介导的免疫细胞治疗是一种很有前景的肿瘤治疗手段。CD5 是一种泛 T 细胞( pan T Cell) 表面标记，在双特异性抗体介导 T 细胞对肿瘤靶向治疗的过程中，CD5 可以取代 CD3 和 FcR 作为双特异抗体在 T 细胞表面的结合点，并消除这两者和配体交联后引发的副作用［1-2］。另一方面在 T 淋巴细胞瘤中由于CD5 的表达上调，因此 CD5 也被选作治疗靶点［3-4］。本文 拟 采 用 基 因 工 程 手 段，构 建 scFv anti-CD5 /pET22b( + ) 重组质粒，原核表达重组蛋白。为构建以 scFv anti-CD5 为构件的双特异抗体以及免疫偶联物提供物质前提，并为其应用于肿瘤的免疫治疗提供基础。1 材 料菌种 E． coli BL21 ( DE3 ) 、E． coli DH5α 和质粒pET22 b( + ) ，Novagen 公司; 细胞株 EC304，南京凯基生物技术有限公司; 细胞因子诱导的杀伤细胞( CIK) ，长春藤生物技术有限公司; Pfu DNA 聚合酶，天根生物技术有限公司; NcoⅠ和 XhoⅠ内切酶、162中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期T4DNA 连 接 酶，NEB 公 司; Ni-NTA agarose，GE 公司; HRP 标记抗 His-tag 兔多克隆抗体，北京康维世纪生物技术有限公司; 异硫氰酸酯荧光素 ( FITC) ，Amresco 公司。引物由上海生工合成。EPICS XL 流 式 细 胞 仪，美 国 Beckman-Coulter公司。2 方 法2． 1 重组质粒的构建2． 1． 1 基因序列与引物设计 从 NCBI Genbank 里查到 DNA 序列 M90468 和 M90467，扣除前面 66 bp的 pelB 信号肽序列后得到的即是 anti-CD5 的重链可变区 VH 和轻链可变区 VL 的序列。在 VH 和 VL之间插入 linker-( G4S) 3 编码序列，在 VH 的 5'添加NcoⅠ酶切位点，在 VL 的 3'端添加 XhoⅠ酶切位点，并在整个基因两端添加保护碱基序列，并通过 E．coli 高频率简并密码子取代原始序列中的稀有密码子，设计出的目的基因 scFv anti-CD5 序列( 共计 741bp) ，合成 10 条拼接引物 F1-R10，以及一对扩增引物 F11 和 R11( 表 1) 。2． 1． 2 重组质粒的构建 将 F1-R10 等 10 条拼接引物，温育获得基因 scFv anti-CD5，温育反应条件为: 95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 30 s，68 ℃温育 2h; 72 ℃延伸 10 min。加入 F11 和 R11 扩增目的基因，扩增反应条件为: 95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min; 33 个循环后，72 ℃延伸 10 min，对 PCR 产物进行 1． 2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定后以 NcoⅠ和 XhoⅠ酶切 PCR 产物，回收和纯化酶切产物，在 T4 连接酶的作用下将其插入到经同种酶切的 pET22b ( + ) 中，获得重组质粒并转化到 E． coli DH5α 中。随机挑选转化子，进行菌液 PCR 筛选，选择 PCR 反应产物和理论设计值大小一致的克隆送上海 Invitrogen 公司测序。2． 2 重组蛋白在 E． coli 中的表达、纯化与复性将测序正确的重组质粒 scFv anti-CD5 /pET22 b( + ) 转化到 E． coli BL21 ( DE3 ) ，挑取单菌落，接种到含终浓度 50 μg /mL 氨苄西林( Amp) 的 LB 培养液 3 mL 中，37 ℃，250 r /min 振荡培养过夜; 再按1∶100稀释至含终浓度 50 μg /mL Amp 的 LB 培养液300 mL 中，37 ℃振荡培养至 A600 为 0． 6 ～ 0． 8; 加入异丙 基-β-D-硫 代 半 乳 糖 苷 ( IPTG ) 至 终 浓 度 0． 1mmol /L，37 ℃，250 r /min 诱导 6 h。包涵体溶解后的上清液，用镍亲和色谱柱纯化，操作过程参照 GE公司提供的操作指南进行。纯化后的蛋白对含 1%PEG4000、0． 4 mol /L 精氨酸的 100 mmol /L Tris 缓冲液( pH 8． 7) 透析复性。2． 3 scFv anti-CD5 的 FITC 标记对 0． 1 mol /L 碳酸盐缓冲液透析后的 scFv anti-CD5，浓缩 到 1 mL ( 约 200 μg /mL ) ，往 其 中 加 入1 mg /mL FITC 溶液 12 μL，置 4 ℃反应 4 h，用超滤管 4 ℃离心重悬数次以去除游离的荧光素，测得 A280=0． 084，A495 = 0． 100，将 scFv anti-CD5-FITC 均分 4份，将最后一次离心得到的穿出液吸出 1 mL，平均分为 4 份。整个过程注意避光。2． 4 流式细胞仪检测 scFv anti-CD5 的活性收获对数生长期的细胞，冰冷的 PBS ( pH 7． 4)洗涤 2 次; 4%多聚甲醛溶液重悬并室温固定 30 min以上，冰冷的 PBS ( pH 7． 4) 复洗 2 次; 血球计数板计数后，调整各种细胞浓度至 2． 5 × 105，取细胞 1 mL，离心后用细胞封闭液封闭 2 h，用冰冷的 PBS 洗 2 遍，然后加入等量的 scFv anti-CD5-FITC，4 ℃ 避光反应12 h，冰冷的 PBS ( pH 7． 4) 洗去未结合蛋白 ( 每步离心条件均为: 4 ℃，1 200 r /min，6 min) ; 洗涤 5 次，加入 PBS 至 1 mL，300 目尼龙网过滤后上机检测。2． 5 细胞膜蛋白提取分别收集 EC304、CIK 细胞后，冰浴超声破碎，9 000 r /min 离心 10 min，去除未破裂的细胞和细胞核碎片，然后取上清，加入适量体积的 solution B，43 000 r /min 超速离心 1 h，即得到细胞的总膜蛋白粗提物。2． 6 Western blotting取细胞总膜蛋白 10 μg 上样，10% 聚丙烯酰胺SDS-PAGE 电泳，100 mA 电流半干转 2 h; 2% BSA室温封闭 2 h，倾去封闭液，将硝酸纤维素膜放入干净的培养皿中，分别加封闭液稀释的 scFv anti-CD5，scFv anti-CD5 约为 5 μg /mL，4 ℃ 过夜; TBST 洗 3次，每次 5 ～ 10 min，加入 1∶1 000 稀释的 HRP 标记抗 His-tag 兔多克隆抗体，室温放置 1． 5 h; TBST 洗 3次，每次 5 ～ 10 min; DAB 显色。3 结 果3． 1 重叠 PCR 构建 scFv anti-CD5将 F1-R10 等 10 条拼接引物，温育获得含基因scFv anti-CD5 的混合物，以此为模板，用 F11 和 R11为引物，常规 PCR 扩增出 scFv anti-CD5 基因。如图1 所示，在泳道 2 中从 100 ～ 800 bp 之间的弥散状条带为重叠 PCR 的产物，泳道 1 为 F11 和 R11 扩增拼接产物后得到了两条带，其中一条在 740 bp 左右，可能是目的基因。纯化产物位于 740 bp 左右，与理论设计值一致。262 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期表 1 引物序列Fig． 1 Sequence of primers序号 引物F15'-CATGCCATGGGTAACATCCAGTTGGTGCAGTCCGGCCCTGAGCTGAAGAAGCCTGGCGAGACTGTGAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTG-3'R25'-AGCCCATCCAACGCAGACCCTTACCTGGAGCCTGCTTCACCCAGTTCATACCATAGTTGGTGAAGGTATAGCCAGAAGCCTTGCAGGA-3'F35'-CTGCGTTGGATGGGCTGGATCAACACCCACACTGGCGAGCCTACTTATGCTGATGACTTCAAGGGTCGCTTTGCCTTCTCTTTGGAAA-3'R45'-GGGTACAGAAATAGGTAGCCGTGTCCTCATTTTTGAGGTTGTTGATCTGCAGATAGGCAGTGCTGGCAGACGTTTCCAAAGAGAAGGC-3'F55'-ACCTATTTCTGTACCCGTCGTGGTTACGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCTGGAACCACGGTCACCGTATCTTCCGGTGGAGGCG-3'R65'-GCATACATGGAAGACGGAGACTGGGTCATTTTGATGTCCGATCCGCCGCCACCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGAAGA-3'F75'-CGTCTTCCATGTATGCATCTCTGGGTGAGCGTGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGCCAGGACATTAATAGCTATCTGAGCTGGTTCCAT-3'R85'-AACGAGATGGGACACCATCTACCAAACGGTTTGCACGATAGATCAGGGTCTTAGGAGATTTGCCTGGTTTATGATGGAACCAGCTCAGA-3'F95'-GGTGTCCCATCTCGTTTCAGCGGCAGCGGCTCTGGCCAAGATTATTCCCTCACCATCAGCAGCCTGGACTATGAAGATATGGGTATTTA-3'R105'-TGGATCCTTTCATCTCAAGCTTGGTACCGCCACCGAACGTCCACGGAGACTCATCATACTGTTGACAATAATAAATACCCATATCTT-3'F11 5'-CATGCCATGGGTAACATCC-3'R12 5'-GCCCTCGAGTTTCATCTCAAG-3'1． 拼接后首次 PCR 扩增产物; 2． 拼接产物; 3 ～ 10． 目的基因纯化后PCR 扩增产物; 11． 纯化后的基因; 12． DNA marker1． PCR product using the mixture from lane 2 as template; 2． Product ofoverlapping PCR; 3-10． PCR product from purified target gene; 11． Puri-fied target gene; 12． DNA marker图 1 scFv anti-CD5 基因的构建Fig． 1 Gene construction of scFv anti-CD53． 2 scFv anti-CD5 重组子的复筛基因和载体连接后，转化 DH5α 感受态细胞，挑取 3 个单菌落，以 F11 和 R11 为上下游引物进行PCR 复筛鉴定，1． 2%琼脂糖凝胶电泳显示在 700 ～800 bp 处均有一特异性亮带( 图 2 ) ，与理论设计值相符，测序结果进一步证明 2 号和 3 号菌落含有序列正确的重组质粒 scFv anti-CD5 /pET22b( + ) 的克隆( 测序结果略) 。1 ～ 3． 1 ～ 3 号菌落的菌液 PCR 产物; 4． DNA marker1-3． PCR product of scFv anti-CD5 recombinant bacterium colony No． 1-3using primers F11 and R11 as primers; 4． DNA marker．图 2 scFv anti-CD5 重组子筛选 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分析Fig． 2 Analysis of PCR product of scFv anti-CD5 recombinantusing primers F11 and R113． 3 融合蛋白 scFv anti-CD5 在 E． coli BL21( DE3)中的表达诱导 scFv anti-CD5 表达后，将菌体裂解，分别收集超声上清、沉淀进行电泳，经过染色、脱色，结果如图 3 所示。在相对分子质量( Mr ) 约 28 000 处有一明显的表达带，而未诱导菌没有出现相同的条带，同时观察到目的蛋白绝大部分存在于超声沉淀中，说明融合蛋白在宿主菌中主要以包涵体的形式存362中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期在。包涵体处理后，过镍亲和柱纯化，电泳后几乎只出现 1 条蛋白质条带，说明经亲和色谱纯化到较高的纯度。1． 未诱导的菌样; 2． 诱导后的菌样; 3． 超声破碎的上清液; 4． 包涵体洗涤样品; 5． 包涵体; 6． 纯化后的样品; 7． 蛋白质 marker1． scFv anti-CD5 /pET22b( + ) without IPTG; 2． scFv anti-CD5 /pET22b( + ) with 0． 1 mm IPTG for 6 h; 3． Lysate supernatant of sample in lane2; 4． Inclusion body washing supernatant; 5． Inclusion body; 6． PurifiedscFv anti-CD5 protein; 7． Marker图 3 蛋白表达形式以及纯化Fig． 3 Protein expression analysis and purification．3． 4 流式细胞仪检测 scFv anti-CD5 的活性CD5 仅在 T 淋巴细胞及其分化亚群高表达，CIK 细胞是 T 细胞在体外由 anti-CD3 和 IL2 诱导分化得到的 CD5 阳性细胞株［2］。将 scFv anti-CD5 标记上 FITC 后，用流式细胞仪检测 scFv anti-CD5 结合 CD5 的能力。结果如图 4 所示，EC304 组和 CIK组的平均荧光强度分别为 1． 19 和 6． 83; 可见 scFvanti-CD5-FITC 特异的结合到了 CIK 上。A． EC304 细胞; B． CIK 细胞A． EC304 cell; B． CIK cell图 4 流式细胞术检测 scFv anti-CD5 活性Fig． 4 Flow cytometry for cell labeled with scFv anti-CD5-FITC3． 5 scFv anti-CD5 结合 CD5 能力的验证采用 Western blotting 的方法进一步分析 scFvanti-CD5 是否特异的结合到 CD5 分子上。结果如图 5 所示，在 Mr 约 67 000 有条带，这个位置与文献报道的 CD5 的位置相符［5］，说明得到的 scFv anti-CD5 能够识别 CD5 抗原。4 讨 论本 研究成功地构建了 scFvanti-CD5 / pET22 b1． 预染 Marker; 2． EC304 膜蛋白; 3． CIK 膜蛋白1． Prestained Marker; 2． Total memberane of EC304; 3． Total memberaneof CIK图 5 Western blotting 分析 scFv anti-CD5 的抗原结合特异性Fig． 5 Western blotting analysis of antigenic specificity of scFv anti-CD5( + ) 重组质粒，表达的蛋白纯化复性后能够特异的识别 CD5 抗原。目前常用的 CD5 抗体多为鼠源性的完整抗体。这些抗体人体内反复使用可引起人体产生人抗鼠抗体反应; 完整的抗体 Mr 大，不易穿透各种屏障; 而且它们的 Fc 段的存在可使其与体内具有 Fc 受体的非特异组织细胞结合，影响其靶向效果。完整抗体的这 3 个缺点使之在临床的应用方面大大受到限制，而且用杂交瘤技术生产完整抗体( mAb 或 bsAb) 的成本比较高，不利于大量的制备。反观单链抗体，其免疫原性低、组织穿透能力强，不具有 Fc 片段，而且可以在原核系统中高效表达，克服了完整抗体的 4 大缺陷，因此本研究结果有着重要的意义。然而，由于单链抗体只有一个抗原结合位点，因此其结合抗原的能力较弱。本研究的实验结果也印证了这一点，流式细胞术和 Western blot-ting 的结果信号都不是很强。通过化学交联或对单链抗体进行多聚化改造，可望增强其亲和力。参考文献:［1］ Weiner L M，Holmes M，Richeson A，et al． Binding and cytotoxicitycharacteristics of the bispecific murine monoclonal antibody 2B1［J］． J Immunol，1993，151: 2877-2886．［2］ Tita-Nwa F，Moldenhauer G，Herbst M，et al． Cytokine-induced kil-ler cells targeted by the novel bispecific antibody CD19 × CD5( HD37 × T5． 16 ) efficiently lyse B-lymphoma cells［J］． CancerImmunol Immunother，2007，56( 12) : 1911-1920．［3］ Miller R A，Oseroff A R，Stratte P T，et al． Monoclonal antibodytherapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma［J］．Blood，1983，62: 988-995．［4］ Kjer-Nielsen L，Dunstone M A，Kostenko L，et al． Crystal structureof the human T cell receptor CD3 epsilon gamma heterodimer com-plexed to the therapeutic mAb OKT3［J］． Proc Natl Acad SciUSA，2004，101: 7675-7680．［5］ Lankester A C，van Schijndel G M，Cordell J L，et al． CD5 is asso-ciated with the human B cell antigen receptor complex［J］． Eur JImmunol，1994，24: 812-816．462 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期

抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18400/%e6%8a%97CD5%e5%8d%95%e9%93%be%e6%8a%97%e4%bd%93%e7%9a%84%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e6%9e%84%e5%bb%ba%e3%80%81%e8%9b%8b%e7%99%bd%e7%ba%af%e5%8c%96%e5%8f%8a%e6%b4%bb%e6%80%a7%e9%89%b4%e5%ae%9a.pdf?sequence=1&isAllowed=y

抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定

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